1. 直腸吸引生検(RSB)切片の準備
- 直腸吸引生検を4%パラホルムアルデヒドに6時間入れて、組織を固定します。固定液量はティッシュ液量の5倍でご使用ください。
- 病理学的組織脱水機を使用して組織を11時間脱水します。プログラムされたプロセス全体は、次の5つのステップで構成されています。
- 組織をホルムアルデヒドに入れ、1時間固定します。
- 組織を75%エタノールに4時間置きます。
- 組織を無水エタノールに入れます(2回交換、各1時間)。
- 組織を無水エタノールに入れます(2回の交換、各30分)。
- 組織をキシレンに入れます(3回の交換、各1時間)。
- 組織をパラフィンワックス(58-60°C)に入れます(3回交換、各1時間)。RSB組織をパラフィンブロックに埋め込みます。
- ミクロトームを使用して、組織が完全な断面平面で完全に露出するまでパラフィンブロックをトリミングします。
- ブロックをミクロトームで0.4μmの切片に切ります。
- 切片を45〜50°Cの水にそれぞれ数秒間入れて、切片が平らなプレートに広がるようにします。
- パラフィン切片をスライドに移します。
- スライドを60°Cのオーブンで3〜5時間焼きます。抗原の損失につながる可能性のある長時間のベーキングは避けてください。
- 脱パラフィン化したスライドをキシレンに入れます(2回の交換、各15分)。
- スライドを無水エタノール、95%、80%、75%エタノールでそれぞれ5分間水和します。その後、逆浸透(RO)精製水でさらに5分間すすぎます。
2. 抗原賦活化
- 4 mLのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)抗原賦活化緩衝液と200 mLのRO精製水を混合することにより、カルレチニン賦活化用の作業希釈液を作製します。S100およびProtein Gene Product 9.5(PGP9.5)の回収用に、1 mLのクエン酸クエン酸ナトリウムバッファー(100倍)と99 mLのRO精製水を混合して、作業希釈液を作成します
注:カルレチニンは、EDTA回収液によって優先的に回収できます。.ただし、クエン酸クエン酸ナトリウムバッファーは、S100およびPGP9.5の検索により適しています。
- スライドをコプリン染色ジャーに入れます。瓶に回収液を入れ、予熱した沸騰水浴に入れます。20分間沸騰させた後、瓶を水浴から取り出し、室温まで冷まします。冷却プロセスには約10分かかります。スライドを取り外し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で一度やさしくすすいでください。
- ティッシュの周りにマーカーペンで円を描き、以下の手順でウェットボックスを用意します。
3. ブロッキング
- 3 mLの30%H2O2を27 mLのRO精製水と混合して、作業希釈液を作成します。
- 3%H2O2溶液を組織に2〜3滴滴下して、ペルオキシダーゼをブロックします。H2O2溶液を速やかに追加して、円からオーバーフローしないようにします。ペルオキシダーゼを37°Cのインキュベーターで20分間ブロックします。
- スライドをPBSでやさしくすすぎます(3回の洗浄、各5分)。
- スライドを5%ウシ血清アルブミン(BSA、1.5 gのBSA粉末と30 mLのRO精製水と混合して調製)で37°Cで20分間ブロックします。
注:3%過酸化水素によるブロッキングは非特異的染色の95%を防ぐことができ、5%BSAによるブロッキングは残りの5%の非特異的染色を防ぐことができます。2つの方法を組み合わせて、信頼性の高い結果を得ることができます。
4. 抗原抗体反応
- 5% BSAを取り出し、50 μLの一次抗体(カルレチニン、S100、またはPGP9.5)をスライドに加えます。4°Cで一晩インキュベートします。
- スライドをPBSで洗浄します(3回、各3分)。
- 50 μLのポリマーエンハンサー(試薬A;材料表を参照)を切片に加え、37°Cのインキュベーターで20分間インキュベートします。次に、スライドをPBSで洗浄します(3回、各3分)。
- 切片に50 μLの二次抗体B(ヤギ抗ウサギ/マウスIgG二次抗体)を添加し、37°Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。切片をPBSで洗います(3回、各5分)。
5. 3,3-ジアミノベンジジンとヘマトキシリンの染色
- 1.5 mLチューブに850 μLのRO精製水を加え、染色試薬(材料表を参照)をA、B、Cの順で添加します。各試薬を50 μL加えると、合計1 mLの3,3-ジアミノベンジジン(DAB)ワーキングソリューションが得られます。沈殿物がある場合は、ろ過後の溶液を使用してください。
- 組織切片にDABワーキング溶液を一滴加え、3〜10分間染色し、スライドを室温で茶色の染色が検出されるまでインキュベートします。明視野顕微鏡を使用して注意深く監視します。DABの作業溶液を光から遠ざけてください。次に、スライドをPBSで5分間洗浄します。
- ヘマトキシリンを一滴加えて、核を約1分間対比染色します。次に、コプリンジャーを保持し、余分な染料が除去されるまで約30〜40秒間、水で洗います。ティッシュ切片を傷つけないように注意してください。
- RSBスライドをPBSを含むコプリンジャーに25〜30秒間浸します。次に、1%塩酸-エタノールで10秒間分化します。スライドをPBSで1分間洗浄します。
- 水分補給の逆の順序でスライドを脱水します:75%、80%、95%、無水エタノール(各5分)。
- スライドをキシレンにさらします(2回、各5分)。
- ウルトラクリーンマウントを使用してカバースリップを取り付けます。スライドを乾燥させてから、顕微鏡で視覚化します。