動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1. 解剖液と人工脳脊髄液の調製
- 超純水(抵抗率18.2MΩ・cmでろ過した水)をカルボゲン(95%O2/5%CO2)でエアストーンバブルディフューザー(水槽用エアレーター)を用いて5分間カルボギナ化
手記：エアストーンは、標準のシリコンチューブを介してカルボゲンタンクのレギュレーターに接続できます。エアストーンが利用できない場合は、シリコンチューブの端をシールで閉じ、シールに小さな穴を開けて、カルボゲンガスが泡立ち、溶液がカルボゲン化されるようにします。
- 表1の溶質を超純水に溶解して解剖液を調製します。CaCl2を少なくとも5分間カルボジン化された溶液に加えて、溶解を助けます.
手記：あるいは、最初にCaCl2を添加して、不飽和溶液に容易に溶解できるようにします。溶液は、液体の形で、300〜320 mOsm / Lで、カルボゲンで飽和した後のpHは7.4である必要があります。
- 解剖液を0〜4°Cに冷やし、溶液を冷蔵庫に一晩置くか、溶液を冷凍庫に1時間入れて温度を継続的に監視します
手記：解剖液は最大3泊保存できます。後で破棄します。
- 使用前に解剖液を5〜10分間炭水化物化します.
手記：理想的には、溶液はスラッシュとして表示されるか、使用前にスラッシュに移行している必要があります。
- 表2の溶質を超純水に溶解することにより、げっ歯類の人工脳脊髄液(ACSF)を調製します。ACSF溶液を35°Cに加熱した水浴中で使用までカルボギン化します。CaCl2を少なくとも5分間カルボジン化された溶液に加えて、溶解を助けます.
手記：あるいは、最初にCaCl2を添加して、不飽和溶液に溶解しやすくします。溶液は、液体の形で、290〜320 mOsm / Lで、カルボゲンで飽和した後のpHは7.4である必要があります。溶液は、実験の期間に応じて、1、2、または4 Lの容量で作製する必要があります。丸一日(8時間)の実験のために4Lを作ります。ACSFは毎日新鮮にする必要があります。1日以上保管しないでください。
2. 脳組織を採取するためのマウス解剖
- 動物の解剖に必要なすべての道具と材料を集めます。動物の解剖に備えるためのワークスペースを設定します。
- カルボゲンタンク(95%O2 / 5%CO2)をチェックして、空でないことを確認します。残りの圧力が500psi未満の場合は、実験前にガスボンベを交換してください。
- ビブラトーム(振動ブレードティッシュスライサー)は、メーカーの取扱説明書に従って校正します。ビブラトームの設定を調整して、切断振幅を1 mm、切断速度を0.12 mm / s.
に設定します。
手記：最適な設定は、個々の振動ティッシュブレードカッターごとに異なる場合があります。ただし、一般的には、振幅は大きく、切断速度は遅くする必要があります。
- ブレインスライスインキュベーションチャンバー(すなわち、ブレインスライスキーパー)をACSFで満たし、カルボゲンで泡立てます。次に、インキュベーションチャンバーを35°Cに設定されたウォーターバスに入れます。
- 13 d(p13)から21 d(p21、p0は生年月日)までの性別の幼体マウスを入手します。
- ペントバルビタールナトリウム(体重55 mg / kg)の腹腔内注射でマウスに麻酔をかけます。.マウスが深く麻酔をかけられたら、つま先のつま先つまみ反射がないことからわかるように、獣医が承認したギロチン器具をすぐに使用して、1回の素早い動きでマウスの首を切ってください。
手記：ペントバルビタールナトリウム注射は、施設のガイドラインで推奨されている手順に従って準備します。.
- ネズミの鼻を持って斬首された頭を安定させ、ネズミの目の間と頭皮の全長に沿って正中線をゆっくりと切開して頭蓋骨を露出させます。かみそりによって加えられる圧力によって頭蓋骨が圧迫されていないことを確認してください。かみそりの刃の角を使用して、カット精度を上げます。
- マウスの頭皮のフラップを指で広げて頭蓋骨を露出させます。次に、かみそりの刃の新鮮な角を使用して、頭蓋骨の正中線に沿って切開を行います。大脳皮質との接触を避けるために細心の注意を払ってください。
- マウスの眼窩に破片鉗子を挿入して、斬首された頭部を安定させ、冷(0〜4°C)解剖液で満たされたシャーレに入れます。ヘッドが解剖液に完全に浸かっていることを確認します。
- 2セット目の破片鉗子を使用して、マウスの頭皮をそっと剥がし、鼻骨を剥いて鼻骨を取り除き、頭蓋骨の背面(尾側)を取り除きます
手記：幼若マウスの鼻骨は非常に柔らかく、簡単に折れます。
- マイクロスパチュラを使用して、視神経、三叉神経、脊髄を切断します。次に、マイクロスパチュラを使用して、脳を頭蓋骨からそっと分離します。解剖液で満たされたシャーレに脳を完全に沈めておきます。
3. 体性感覚運動皮質からの皮質スライスの調製
- ビブラトームのバッファートレイに~150 mLの冷(0 - 4°C)解剖液を入れます.
手記：必要に応じて、スライス手順中に低温を維持するために必要になるまで、バッファートレイを冷凍庫に保管します。
- マウスの脳組織をビブラトームステージ(検体ホルダー/トレイ)に瞬間接着剤で接着します。マウスの場合は、脳の小さな尾側部分(つまり、小脳)を切り取り、標本ホルダーに簡単に平らに接着できるようにします(脳の吻側が天井を向くようにします)
手記：あるいは、脳の背側を標本ホルダーに接着することにより、水平マウス脳スライスを調製することができる(脳の腹側が天井を向くべきである)。
- 検体ホルダー(脳組織入り)をバッファートレイにそっと置きます。脳の背側部分がビブラトームの刃に面していることを確認します。
手記：脳が空気にさらされる時間を最小限に抑えることが重要です。
4. 脳組織の切片化と採取
- 背側から腹側方向のビブラトームを使用して、脳を450μmの厚さのスライスにスライスします。脳をスライスする際に、脳が標本トレイに完全に固定されていることを確認してください。
- マウスの脳に最初の切り込みを入れて、嗅球を取り除きます。次に、体性感覚運動野が観察されるまで(嗅球とブレグマのほぼ中間に位置する)まで、その後のカットを行います
手記：必要に応じて、脳梁が脳の冠状図に現れるまで、脳をより薄い(200μm)スライスでスライスします。これは、体性感覚運動野が近いことを示します。
- ワイドボアトランスファーピペットを使用して、体性感覚運動領域を含むコロナスライス(450μm)を収集し、冷たい(0〜4°C)解剖溶液を含むシャーレに浸します。
- 新しいかみそりの刃を使用して、スライスから余分な組織を切り取ります。マウスの冠状スライスの場合は、新皮質交連(すなわち、脳梁)のすぐ下に横切開を行います。のこぎりで切る動作をしないでください。ブレードをティッシュに圧力をかけ、ディテールブラシを使用してティッシュをやさしく分離します。冠状スライスの動きを最小限に抑えるようにしてください。
- 大口径トランスファーピペットを使用して、新皮質(レイヤー1〜6)を含む冠状スライスの背側部分を、温かい(35°C)ACSFで満たされた2番目のシャーレに一瞬(~1秒)移します。その後、速やかにスライスを温かい(35°C)カルボジン化ACSF.
を含むインキュベーションチャンバーに移します。
手記：ACSFを使用したペトリ皿への移送の目的は、ワイドボアピペットで脳スライスを移送しながら、インキュベーションチャンバーへの解剖液の移送を最小限に抑えることです。インキュベーションチャンバーの複数のウェルを利用して、さまざまな脳スライスを整理します。
- 残りの脳と動物の死骸は、施設のガイドラインに従って廃棄します。
5. インキュベーションとメンテナンス
- 脳スライスをインキュベーションチャンバーに35°Cで30分間少し沈めておきます。次に、インキュベーションチャンバーをウォーターバスから取り出し、室温(20〜25°C)に戻します。脳スライスが回復するまで1時間待ってから、電気生理学的記録を行います。
手記：インキュベーションチャンバー内の脳スライスの下に気泡が溜まっていないことを確認してください。気泡は、組織の損傷を引き起こす空気界面です。マウスの脳スライスは、ACSFを備えた十分に炭水化物化されたインキュベーションチャンバーで6〜8時間維持できます。
6. 皮質表層の電気生理学的記録
注:発作イベントは、脳スライスからの細胞外局所電位(LFP)記録で観察されます。脳スライスのLFPは、インターフェースタイプのチャンバーまたは水中多電極アレイ(MEA)システムのいずれかで観察および記録できます。
- ワイドボアトランスファーピペットまたはディテールブラシを使用して、デンタルピンセットを使用して所定の位置に保持されている少し大きめのプレカットレンズペーパーに脳スライスを移動します。レンズペーパー(脳のスライスが置かれているもの)を記録チャンバーに移し、ハープスクリーンで所定の位置に固定します。
- 加温(35°C)のカルボゲン化ACSF灌流液を記録チャンバーに通し、脳切片を3 mL/分(~1 drip/s)の速度で流します。デジタル温度計を使用して、記録チャンバーが33〜36°Cであることを確認します。
- インピーダンス1〜3MΩのガラス電極をホウケイ酸ガラス管(外径1.5mm)から引き抜きます。Hamilton シリンジを使用して、ガラス電極を ACSF (~10 μL) で埋め戻します。先端が損傷している場合は、すぐに電極を廃棄してください.
手記：銀線を漂白し(5分)、銀線の最小限の部分(つまり、先端)のみをACSFバックフィルドガラス電極に沈めることで、録音中のノイズとドリフトを最小限に抑えます。必要に応じて、ハミルトンシリンジでガラス電極から余分なACSFを取り除きます。.
- 20倍実体顕微鏡を使用して、手動マニピュレータを使用して記録ガラス電極を表在皮質層(2/3)に正確にガイドします。標準ソフトウェアを使用して、脳スライスの電気的活動をコンピューター上に記録/表示します。
手記：生存可能な(高品質の)脳スライスは、光遺伝組織に対して印加された電気刺激(100μs、30〜300μA)または光パルス(30ms、10mW / mm2)に応答して、強力な誘発電位を示します。
7. 発作様活動の誘発
- 100 μM 4-アミノピリミジン (4-AP) を含む ACSF を脳切片に灌流します。80 mg の 4-AP を 8.5 mL の水に溶解して 100 mM 4-AP のストック溶液を作製します。100 mL の ACSF に 100 μL の 100 mM 4-AP ストック溶液を添加して、100 μM の 4-AP で ACSF 灌流を行います< />
手記：あるいは、Mg2+を添加していない修飾ACSF溶液であるZero-Mg2+ ACSF(表3)を使用して、脳切片を灌流します。発作イベントが発生するまでの平均時間は 15 分です。ただし、一部の脳のスライスには最大40分かかる場合があります。
8. オンデマンド発作作製:光遺伝マウスのための光遺伝学的戦略
- 青色光(470 nm)の短時間(30 ms)パルス(最小出力強度1 mW/mm2)を印加して、発作イベントを開始します。手動マニピュレータを使用して、記録領域の真上に1,000μmのコア径の光ファイバー(0.39NA)を配置します.
手記：光刺激の速度を、発作イベントの発生の望ましい速度(つまり、50秒ごとに1パルス)に一致するように設定します。ただし、この速度は、発作イベントが発生する固有の速度から過度に誇張することはできません。
表1:解剖液のレシピ。これらは、1Lまたは2Lの容量を作成するための手順です。MW = 溶質の分子量。
名
銭
名
銭
名
名
銭
| # | 試薬 | コンク [mM] | MW (グラム/モル) | 1L(g) | 2L(g) |
| 1 | 蔗糖 | 248 | 342.3 | 84円89銭 | 169円78 |
| 2 | 重炭酸ナトリウム(NaHCO2) | 26 | 84円01 | 2.18 | 4.37 |
| 3 | デキストロース(D-グルコース) | 10 | 180.16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | 塩化カリウム(KCl) | 2 | 74円55銭 | 0.15 | 0.3 |
| 5 | 硫酸マグネシウム(MgSO4・7H2O) | 3 | 246.47 | 0.74 | 1.48 |
| 6 | リン酸ナトリウム一塩基性一水和物(H2NaPO4・H2O) | 1.25 | 137円99銭 | 0.17 | 0.34 |
| 7 | 塩化カルシウム(CaCl2・2H2O) | 1 | 147円01 | 0.15 | 0.29 |
表2:げっ歯類の人工脳脊髄液(ACSF)のレシピ。これらは、2Lまたは4Lの容量を作成するための手順です。MW = 溶質の分子量。
名
名
銭
名
名
銭
| # | 試薬 | コンク [mM] | MW (グラム/モル) | 2L(g) | 4L(g) |
| 1 | 塩化ナトリウム(NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28円73銭 |
| 2 | 重炭酸ナトリウム(NaHCO2) | 26 | 84円01 | 4.37 | 8.74% |
| 3 | デキストロース(D-グルコース) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | 塩化カリウム(KCl) | 4 | 74円55銭 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | 硫酸マグネシウム(MgSO4・H2O) | 1.3 | 246.47 | 0.64 | 1.28 |
| 6 | リン酸ナトリウム一塩基性一水和物(HNaPO4・H2O) | 1.2 | 137円99銭 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | 塩化カルシウム(CaCl2・2H2O) | 1.5 | 147円01 | 0.44 | 0.88 |
表3:Zero-Mg2+げっ歯類人工脳脊髄液(Zero-Mg2+ ACSF)のレシピ。これらは、2Lまたは4Lの容量を作成するための手順です。MW = 溶質の分子量。
名
名
銭
名
名
銭
| # | 試薬 | コンク [mM] | MW (グラム/モル) | 2L(g) | 4L(g) |
| 1 | 塩化ナトリウム(NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28円73銭 |
| 2 | 重炭酸ナトリウム(NaHCO2) | 26 | 84円01 | 4.37 | 8.74% |
| 3 | デキストロース(D-グルコース) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | 塩化カリウム(KCl) | 4 | 74円55銭 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | 硫酸マグネシウム(MgSO4・H2O) | 名目上は自由 | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | リン酸ナトリウム一塩基性一水和物(HNaPO4・H2O) | 1.2 | 137円99銭 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | 塩化カルシウム(CaCl2・2H2O) | 1.5 | 147円01 | 0.29 | 0.59 |
