マウスにおけるペンチレンテトラゾール誘発性てんかん発作モデルの確立

要約

出典:Shimada, T., et al. ペンチレンテトラゾール誘導キンドリングマウスモデル。J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、GABA-A受容体拮抗薬であるペンチレンテトラゾール(PTZ)注射を用いてマウスでてんかんを誘発する過程を実演しています。PTZの腹腔内反復投与は、塩化物イオンの流入を阻害し、抑制性神経伝達を阻害し、発作を引き起こすニューロンの過興奮を引き起こすことにより、発作の閾値を徐々に低下させます。このプロセスは、慢性てんかんを模倣した自然発作の発散と発症をもたらします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ペンチレンテトラゾール (PTZ)

の調製

1. 2 mg/mL PTZ を滅菌 0.9% (w/v) NaCl に溶解します。使用当日にPTZを準備してください。

2. PTZ

の注入

1. すべての実験は午前9時から午後12時(正午)の間に行ってください。
2. 動物の体重を測定します。
3. 動物を観察室に入れて慣れさせます。
4. 慣れ期間(3分)中に、動物の体重と以前に決定された注射用量に基づいて、注射用のPTZ溶液の量を計算します。
   注: 例えば、35 mg/kg PTZを使用する場合、体重25 gのマウスには0.875 mgのPTZが必要です(35 mg/kg x 0.025 kg = 0.875 mg)。したがって、437.5 μL の 2 mg/mL PTZ 溶液を注入する必要があります (0.875 mg/2 mg/mL = 0.4375 mL)。PTZの注射用量は、マウスの遺伝子型と系統によって異なります。野生型C57BL/6マウスの場合、最初の試験では30-35 mg PTZ/kg体重の用量が推奨されます。PTZに対する感受性は、使用するマウス系統によって異なります。注入量は実験の目的によって異なります。
5. 27ゲージの針に取り付けられた1mLシリンジを使用して、動物の腹部の左または右の象限にPTZを腹腔内に注入します。正中線での注入は避けてください。
   1. 同じ位置で繰り返し注入することは避けてください。.
6. PTZ投与後30分間動物の行動を観察し(図1A)、異常行動を以下のように分類し、採点する。可能であれば、特に発作の重症度スコアが3以上に達した場合は、注射後少なくとも6〜10時間、動物を観察下に置きます。.
   1. 30分間の観察期間を超えて動物に軽度の発作や行動の変化がないか注意してください。この長期にわたる観察期間は、てんかんにおける慢性的な誘発性発作の発生におけるPTZの亜痙攣用量の特に重要かつ完全な影響に対処する可能性があります。.
   2. さらに、発作の持続時間の変化が発作の重症度に関連しているため、観察された各発作の発作持続時間を測定します。さらに、PTZ注射後の最初の発作までの潜伏期間は、収集すべき別の重要な手段です。発作の頻度、持続時間、潜伏期間のモニタリングは、発作後の分子研究にとって非常に重要です。
7. PTZを1日おきに注入します(図1A)。注入回数は、実験の目的によって異なります。代表的な例は以下の通りです。
   1. 完全に燃え上がった動物を生成するには、動物がスコア5の発作(強直間代発作)を経験したら、さらに3回の投与で注射を完了します。この場合、発作スコアが3回連続して投与されても増加しない場合は、注射量を増やします。.各動物は、異なる数と用量のPTZ注射を受けることができます。
   2. 抗てんかん薬の評価や遺伝子改変マウスの表現型の研究など、PTZに対する脆弱性を評価するために、あらゆる条件でPTZ注射の回数と用量を固定します。すべての動物に同じ数のPTZ注射を与えます。合計8〜12回の注射が推奨されます。動物が死亡した場合、発作スコアは6と表示する必要があります。
   3. てんかん発作に発生する病理組織学的変化を研究するために、10 回以上の注射で高い発作スコア (4 または 5) を維持するために必要な注射量を決定します。この場合、合計注入回数は 25 から 30 の範囲にする必要があります。発作スコアが5に達したら、注射量を減らします。.発作スコアが3以下に減少した場合は、注射量を増やしてください。.

結果

図1:プロトコルの簡単な説明。(A)PTZ媒介キンドリングの概略図。(B)各発作スコアの代表的な動物行動の図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ペンチレンテトラゾール	シグマ・アルドリッチ	P6500
塩化ナトリウム	マナック	7647-14-5
マウス	クレアジャパン		C57Bl/6NJcl、生後8週間、オス
シリンジ (1mL)	テルモ	SS-01T
ニードル(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	テルモ	NN-2719S
はかり	メトラー	PE2000	こちらの商品は生産終了商品です。A&D社のFX-2000iとFXi-12-JAとほぼ同等です。