ラットモデルにおける中大脳および総頸動脈閉塞による虚血の誘導

要約

出典:Wayman, C. et al., Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability.J. Vis. Exp. (2016)

このビデオは、高齢ラットの総頸動脈またはCCA結紮を使用して、虚血性脳卒中をモデル化するために、永久遠位中大脳動脈閉塞術(MCAO)を実行する手順を示しています。これにより、脳への血流が遮断され、ニューロン死につながり、脳卒中のメカニズムと潜在的な治療法を研究するためのモデルが生成されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 手術

1. 16〜18か月(250〜400 g)の雌の高齢のLister-Hoodedラットを使用し、1.5 L / min O₂の5%イソフルランで麻酔を誘発します。.麻酔導入後、イソフルランのレベルを下げ、手術に適した最小限の深さに維持します(例:、、1.5-2%)。.フェイスマスクで動物に麻酔を送り、外科医のイソフルランへの曝露を制限するために清掃システムを使用します。
   1. 偽の動物に開頭術を含むまでのすべての手順を実行しますが、この手順は行動障害を引き起こす可能性があるためです。中大脳動脈閉塞(MCAO)実験を設計する際には、実験目標を考慮し、開頭術を制御する偽グループを含めるべきかどうかを決定します。
2. 術前または術期に鎮痛剤を投与します(Carprieve、0.25 mg / kg、s.カット)。
   1. 1 mLから19 mLの滅菌0.9%生理食塩水を加えてストック溶液を作り、ラット300 gあたり0.6 mlを注入します。Carprieveの使用は、前者が室温(RT)で安定しているため、Carprofenよりも好まれます。
3. 腹側頸部と右半球の側頭部の毛皮を剃り、皮膚を露出させます。エタノール綿棒を使用して手術部位を消毒します。
   1. この手順を手術領域から離して実行し、切開部位の毛の量を最小限に抑えます。
4. ラットを滅菌ドレープで覆われたコルクボードの上に、加熱パッドの仰臥位に置きます。頭と首の剃った部分にリドカインクリームを塗ります。直腸プローブを挿入して、恒温システムを使用して動物の体温を36.5〜37.5°Cに監視および維持します。
   1. 乾燥を防ぐために涙液軟膏を目に置きます。ラットに硫酸アトロピン溶液(600μg/ml溶液0.05ml、皮下)を注射して、気管分泌を減少させます。.
      注:研究者は、血液ガスや圧力などの生理学的変数の測定を検討する必要があります。
5. 手術を開始する前に、後足のピンチ離脱とまばたき反射をチェックして、完全な麻酔を確認します。
6. 解剖顕微鏡で、メスを使用して露出した首に2cmの中央正中線を切開します。唾液腺を両側の気管の外側にそっと動かします。
7. 片側の総頸動脈を覆う皮膚の周りに非吸収性の絹の縫合糸をループします。シルク縫合糸を使用してその部位から皮膚をそっと引き離し、サージカルテープを使用してコルクボードに貼り付けて、総頸動脈を明らかにします。細かい鉗子を使用して、周囲の筋膜と迷走神経から解放された動脈を慎重に鈍く解剖します。
   1. このステップでは、摂食、嚥下、呼吸が損なわれるため、筋肉や迷走神経を損傷しないように注意してください。
8. 総頸動脈が露出したら、非吸収性の絹の縫合糸(5/0)を使用して頸動脈を分離し、最初に細い鉗子で逆切開し、神経に接触しないように注意しながら迷走神経から頸動脈を分離します。血管が縫合糸とループ状になったら(結ばれていない)、このステップが元に戻らないように、外科用テープを使用して縫合糸の端をテープで固定します。上にある皮膚を支えている縫合糸を取り除きます。
9. 反対側についても繰り返します。
10. 滅菌生理食塩水に浸したガーゼを傷口に挿入して、手術の残りの部分で組織を湿らせます。皮膚をゆるく縫合し、生理食塩水に浸したガーゼを追加でその部分に当てて、さらなる脱水を防ぎます。
11. ラットを横向きの位置に置き、右眼窩と外耳道の中点で皮膚を切開します。コルクボードに固定された最大5つの伸縮性のある3mmフックリトラクターを使用して皮膚を引っ込めてから、側頭筋を鈍く解剖して頭蓋骨を露出させます。
12. サムホイールで重力調整された生理食塩水点滴を開いた部位の上(流量約2ml /分)に置き、骨の破片を取り除き、手術のこの段階で露出した部位から軽度の出血を取り除くための吸引器システムを設定します。
    1. 生理食塩水送達ノズルを耳の近くの頭蓋骨の最高点に配置し、吸引器ノズルを最も低い点に配置します。ブリード中にホイールを調整して、その領域により多くの生理食塩水を供給すると、血管の焼灼のためのブリードの発生源をよりよく視覚化し、動物が麻酔下にある時間を短縮します。
13. 露出した領域(約5 mm x 5 mm)で、粗い1.6 mmのダイヤモンドコーティングドリルバリを約8,000 rpmで使用した歯科用ドリルを使用して開頭術を行い、露出領域を掘削する際に下向きの圧力ではなく、円形および横方向の圧力が加えられるようにします。骨が完全に透明に見えるほど細くなったら、鉗子を使用して取り除きます。
14. 細い鉗子の片方の先端を約180°曲げて弧を描く自家製の硬膜フックを使用し、デリケートで破裂しやすい大きな表面の血管を避けて慎重に硬膜を開きます。
    注: 脳の露出領域は中大脳動脈(MCA)を明らかにします。目的のセグメントの長さは約 2 mm です ( 図 1 を参照)。
15. 下大脳静脈が交差する場所から動脈分岐点までMCAを凝固させ、次に一対のジアテルミー鉗子を使用してMCAの尾枝に沿って完全に閉塞するまで凝固させます。0.25mmの先のとがった先端を持つ角度付きジュエラージアテルミー鉗子を使用してください。
    1. 動脈を閉塞するときは、必要に応じて生理食塩水の流れを変えてこの領域を冷やし、凝固鉗子が血管に付着するのを防ぎます。閉塞すると、血管は黒く見え、血流の兆候は見られません。血流は部分的に閉塞した血管で見ることができます。
    2. この時点でMCAをカットして、完全な閉塞を確認します。微小血管ハサミを使用して、下脳静脈がMCAと交差する場所の下に切り込みます。
    3. 露出した領域を生理食塩水に浸したガーゼパッドで覆ってから、次の手順に進みます。
16. ラットを仰臥位に戻し、首のゆるく結ばれた縫合糸を再度開いて、頸動脈を再度露出させます。閉塞したMCA(右)と同じ側の頸動脈を永久に結紮します 頸動脈の周りの絹の縫合糸に結び目を結ぶことにより、左頸動脈は125gの圧力で13mmのステンレス鋼動脈クリップを使用して一時的に閉塞します 60分間。この間に首の切開部をゆるく縫合し、脱水症状を防ぐために滅菌生理食塩水に浸したガーゼを上に置きます。
    1. 仰臥位の場合、動物の右側は外科医の左側になることに注意してください。

結果

図 1.永久遠位中大脳動脈閉塞モデルの外科的セットアップ。ラット開頭術のセットアップに使用された機器は、右半球、挿入図、吸引器の位置、および頭蓋切除部位の周りの生理食塩水の点滴を示しています。また、血管系の主な特徴も示されています。中大脳動脈(赤)と下大脳静脈(青)が示され、影付きの領域は動脈の凝固が起こる場所を示しています。閉塞の確認は、MCAを下大脳静脈より下に切断することによって行われます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カルプロフェン	ノーブルック	VM番号; 02000/4229	は0.25 mg/kg
硫酸アトロピン	アムテック	RXATRINJ-100
アルコール綿棒	UHSの	20021
リドカインクリーム(エムラ)	アストラゼネカ	12901	剃った首と側頭部にエンドウ豆サイズの滴を塗ります
ホメオサーミックブランケットシステム	ハーバード・インストゥルメンツ	507222F
鉗子	ファインサイエンスツール	11019-12
イソフルラン	アボット	B506
シルク縫合糸	ハーバード・イスプライヤーズ	723288
焼灼システム	エシュマン
0.25 mm ジュエラー焼灼鉗子	エシュマン	8330349
ファインデュモン鉗子	ファインサイエンスツール	11251-10
親指駆動生理食塩水点滴システム
Vacusafe吸引器システム	インテグラ・バイオサイエンス	158320
16 mm 粗いダイヤモンドコーティングされたスチールバリ		K801 104 016
ハンドヘルドデンタルドリル	日本精工	NSKVMAXVRE (ハンドピース NSKEX6B)
バンナス スプリングシザーズ	ファインサイエンスツール	15000-03
微小血管ハサミ	世界の精密機器	501790
4-0 ビクリル縫合糸	エチコン
血管クリップとアプリケーター
手術用顕微鏡	ツァイス
コンパクト麻酔器 イソフルランK/Fシングルガス	VetTechソリューションズ
炭素鋼メス刃 No.10	スワン・モートン	201
25g 針	テルモ	NN-2525R
シリンジ(1mlおよび5ml)	テルモ	SS+01T1 / SS*05SE1
生理食塩水(塩化ナトリウム0.9%)	フレゼニウス・カビ	PL 08828/0178
綿棒	ジョンソン・エンド・ジョンソン	5.00021E+12	使用前に除菌してください
ガーゼ			使用前に除菌してください