マウス脊髄ニューロンの脱髄と再髄鞘形成

要約

出典:Keough, M. B., et al. リゾレシチンの焦点注射によるマウス脊髄の実験的脱髄と再髄鞘化。J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、リゾレシチン注射を使用してマウス脊髄ニューロンの脱髄を誘導し、その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞の遊走と分化を通じて再髄鞘形成を行う方法を示します。このプロセスは、ニューロンの信号伝達を損ない、その後徐々に回復します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 注射用シリンジの準備

1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; pH 7.4) 中の 1% 溶液にリゾレシチンを溶解し、少量アリコート (75 μl) で -20 °C で保存します。バイアルを室温(RT)で解凍します。
   注:リゾレシチンが溶解していない場合は、超音波洗浄機(40kHz)でチューブを約30分間超音波処理し、均一な溶液を形成します。
2. 事前に引っ張られたガラスキャピラリーは、デリケートな先端を傷つけないように細心の注意を払って取り扱ってください。10 μlの注入シリンジのナットを緩め、キャピラリーの平らな端にねじ込み、続いて2つのフェルールにねじ込み、フェルールの嵌合端が揃い、キャピラリーが円錐形のフェルールにぴったりと収まるようにします (図 1シリンジをイソプロピルアルコールですすぎ、プランジャーを取り外します。.乾いたら、針組立手を注射注射器にしっかりとねじ込みます。
3. 金属製のハブニードルをプライミングシリンジに取り付けます。ゴム製の円盤に針を刺し、底までスライドさせます。プライミングシリンジにリゾレシチンを充填します。ニードルの先端に液体が見えるまで、プライミングシリンジを静かに押し下げます。これにより、注入シリンジに気泡が入り込むことがなくなります。
4. プライミングシリンジの金属ハブ針を注入シリンジに挿入します。ゴム製のディスクでしっかりとシールし、毛細管が先端を溶液で満たすまでプライミングシリンジをゆっくりと押し下げます。プライミングシリンジを慎重に取り外し、同時に押し下げて気泡を導入せずに注入シリンジのバレルを満たします。プランジャーを注入シリンジに挿入し、プランジャーを静かに押し下げながら、溶液がキャピラリーの先端から流れることを確認します。
   注:キャピラリーまたは注入シリンジに気泡が見える場合は、シリンジの準備を最初から繰り返す必要があります。注入装置内の連続流体は、正確な注入量を確保するために重要です。
5. 完成した注入シリンジを定位マイクロマニピュレーターのアームに取り付けます。この完成した装置は、補充が必要になる前に15〜20匹の動物を注入することができます。
6. プライミングシリンジから残りのリゾレシチンを廃棄します。.イソプロピルアルコールを数回引き出して押し下げ、金属ハブニードルを外します。プライミングシリンジに残っているイソプロピルアルコールが蒸発するまで数時間待ってから、再度充填します。.

2. 動物を外科的処置のために準備します

注:この手順は、8-10週齢の雌C57BL/6マウスについて説明されています。

1. ケタミン (200 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) の腹腔内注射で動物に麻酔をかけるか、施設の動物管理規則に従って麻酔をかけます。注射麻酔を使用する場合は、動物が約1時間麻酔下にあるように計画してください。
2. 足をしっかりとつまむことで動物が深く麻酔されることをテストします。適切に麻酔をかけられた動物は、ピンチに反応しません。
3. バリカンを使用して、動物の背側、耳の近くで2〜3 cm²の領域を剃ります。耳を傷つけないように注意してください。
4. ガーゼパッドに70%エタノールを塗布して、その部分をきれいに拭きます。クリップされたすべての髪が領域から取り除かれていることを確認します。その部分をヨウ素で消毒します。
5. ワセリンを目に塗り、施術中の乾燥を防ぎます。
6. 手順を開始する準備ができるまで、動物を加熱された回収チャンバーに保管してください。

3. 外科的処置を行う

注:手順のすべてのステップで適切な無菌技術を確認してください。これには、手袋、ヘアネット、マスク、カーテンの適切な使用が含まれます。すべての道具は、動物と接触する前に滅菌する必要があります。

1. 背側を上にして、背側を上にして動物を定位フレームに移動し、折りたたまれたペーパータオルで中央部を持ち上げて背骨の湾曲を誇張します。腕と尻尾をサージカルテープで固定し、頭を歯のクランプで固定します。この手順には、安定化イヤーバーは必要ありません。
2. メスを使用して、耳のすぐ下から尾側方向に切開して、3cmの正中線を切開します。
3. 2つの大きな脂肪構造の間の分娩を見つけ、両手で細い鉗子を使ってこれらを引き離します。リトラクターを広げて術野を開きます。
4. 手術用顕微鏡で、胸椎2(T2)椎骨の顕著な成長過程を見つけます(注:この特徴はC57BL/6マウス系統の特徴です)。閉じたスプリングハサミで重なった筋肉組織を通して鈍い解剖を行い、T2をよりよく視覚化します。鉗子を使用して、胸椎3(T3)と胸椎4(T4)の硬い表面を触り、適切な解剖学的位置を確認します。
5. スプリングハサミを使用して、T3とT4の間の結合組織の浅い横方向の切り込み(深さ2〜3 mm)を行います。マウスの脊柱の上部胸部には椎骨と椎骨の自然な間隔があるため、脊髄を明らかにするために椎弓切除術を行う必要はありません。切り込みが深すぎると、コードが突き刺さって損傷することに注意してください。
   注:このステップでは、少量の出血が一般的です。これが発生した場合は、出血が治まるまで(30〜60秒)スポンジスピアをその領域に保持します。
6. 脊髄を視覚化します。この髄膜層がコードを露出させながらまだ切断されていない場合、それは目に見える硬膜の厚い層で覆われます。目立つ血管は、脊髄のほぼ正中線を通って尾側/吻側を走っています。
   注:この血管系は、正中線の目印として使用しないでください。代わりに、適切な照明により、背柱に隣接する灰白色物質の境界が明らかになるはずであり、それを使用して正中線を推定する必要があります。
7. 硬膜が無傷のままの場合は、クリアされるまで32Gの金属針で横方向に穏やかに擦り傷を付けます。.目標は、硬膜を取り除き、残りの基礎となる髄膜を切らずにすることです。
   注: 脳脊髄液の放出はくも膜の破損を示しており、これは組織に機械的な損傷を与えることなく発生する可能性がありますが、蓄積された脳脊髄液はスポンジスピアで除去して、コードの表面をよりよく視覚化する必要があります。
8. 注射シリンジを所定の位置に移動し、毛細血管の先端が正中線の両側のすぐ外側の脊髄にかろうじて触れるまでゆっくりと下げます。アームを所定の位置にロックします。
9. Z方向定位アームの段階的な測定値を使用して、ベースライン位置測定を行います。この読み取り値から、1.3mmを引きます。すばやく浅い下向きの動きを使用して組織を突き刺し、新しい測定値に達するまで毛細血管を慎重に下げます。オプション:必要に応じて、背柱の病変は、正中線と深さ0.3mmで同じ突き刺し運動によって生成できます。
   注: これらの値は、T3 と T4 の間の注入に特有のものです。脊髄の他の場所で注射を行うことを選択した場合、これらの値は利用可能なマウス脳アトラスから導き出されなければなりません。
10. マイクロマニピュレーターを使用して、リゾレシチンを腹側脊髄白質に押し込みます。.マイクロマニピュレーターを5秒ごとに1回転させて2分間行うと、最終容量は0.5μlになります。溶液の逆流を防ぐためにキャピラリーをさらに2分間そのままにしてから、キャピラリーを慎重に取り外します。
11. 脊柱を覆う筋肉/脂肪組織に単一の縫合糸を結びます。中断のない縫合糸を使用して皮膚を閉じます。切開部位にヨウ素を多く塗布します。
12. 動物が回復するまで加熱された回収チャンバーに入れ、その後ケージに戻します。施設の動物管理規則に従って、術後に鎮痛薬を塗布します。動物は完全に歩行可能であり、麻酔から回復するとすぐに自己栄養と飲酒が可能になるため、通常、追加の術後ケアは必要ありません。
13. 残りの動物についてもこの手順を繰り返します。
    注:熟練すれば、手術は動物1匹あたり10〜15分で完了し、特に縫合糸を結ぶ2人目の人の助けを借りて行うことができます。同じガラスキャピラリーは、先端が鈍くなる前に約15〜20回の手術に使用できます。コントロール手術は、リゾレシチンの代わりに脊髄にPBSを注射することで、説明したように同じように行うことができます。将来の使用のためにキャピラリーをクリーニングすることはお勧めしません。

結果

図 1.注入シリンジの組み立て。(A)注入シリンジのナットは、ガラスキャピラリーの平らな端にねじ込まれ、続いて2つのフェルールがそれらの嵌合端が連動するように通されます。キャピラリーが円錐形のフェルールにしっかりと固定されたら、アセンブリを注入シリンジの端に手でしっかりとねじ込みます。(B)プライミングシリンジに取り付けられた金属ハブ針でゴムディスクの中央をピースし、ベースまでスライドさせます。(C)リゾレシチン溶液をプライミングシリンジに回収します。(D)リゾレシチンの最初の一滴が針の先端に見えるまで、プライミングシリンジを静かに押し下げます。.(E)プライミングシリンジを注入シリンジのバレルに挿入し、ラバーディスクでしっかりと密閉します。溶液が毛細血管の端まで流れるまで、溶液を静かに押し下げます。プランジャーに圧力をかけたままプライミングシリンジを慎重に引き出し、注入シリンジに気泡が入らない...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
春ばさみ	ファインサイエンスツール	15004-08
鉗子	ファインサイエンスツール	11254-20
リトラクター	ファインサイエンスツール	17003-03
クリッパー	フィリップス	QG3330
加熱回収室	Pecoサービス	V1200
サージカルテープ	3M	1527-1
メスの柄	ファインサイエンスツール	10003-12
メスの刃	フェザー	第15号
スポンジスピア	ビーバービジテック	581089
5-0 ビクリル縫合糸	エチコン	J511G
カーブタフカットスプリングハサミ	ファインサイエンスツール	15123-12
32ゲージ金属針	BD	305106
ニードルホルダー	ファインサイエンスツール	12002-14
角度付き鉗子	ファインサイエンスツール	11251-35
コットンチップアプリケーター	ピューリタン	806-WC
ガーゼパッド	セーフクロス応急処置	3763
10 μL シリンジ	ハミルトン	7635-01	ガス密シリンジではなく、マイクロリットルの注射器を購入してください
コンプレッションフィッティング	ハミルトン	55750-01	2つのフェルールと取り外し可能なナットが含まれていますが、10μLシリンジに付属のナットはよりぴったりとフィットします
プライミングキット	ハミルトン	PRMKIT	プライミングシリンジ、取り外し可能なハブニードル、ラバーディスクが含まれています
プリプルガラスキャピラリー	WPI	TIP10TW1(10個入り)	内径10μmのキャピラリーを配合。内径30μmも動作(TIP30TW1)
定位フレーム	デビッド・コップフの楽器	モデル900
超音波洗浄機	フィッシャーサイエンティフィック	FS-20
顕微鏡スライド	VWR	48311-703
明視野顕微鏡	オリンパス	BX51
リゾフォスファティディルコイン	シグマ	L1381
PBS	オキソイド	BR0014
イソプロピルアルコール	シグマ	109827
ケタミン	CDMV
キシラジン	CDMV
ヨウ素	ウェストペネトン	2021年
ワセリンワセリン	VWR	CA05971