タウタンパク質凝集解析のためのヒトニューロンのレンチウイルス媒介形質導入

要約

出典:Aulston, B., et al.ヒトニューロンのレンチウイルス媒介形質導入を用いたタウ凝集を研究するためのIn vitroモデル。

このビデオでは、黄色蛍光タンパク質(YFP)でタグ付けされた変異型ヒトタウタンパク質をコードするレンチウイルスをヒト神経細胞に形質導入し、タンパク質凝集を研究するプロセスを示しています。ウイルスの侵入から変異型タウの発現までのステップを概説し、ニューロンに目に見える細胞質タウ凝集体が形成されるまでのステップを概説しています。

プロトコル

1. 培地と試薬の調製

1. 培養プレート用の基底膜マトリックスコーティングを4°Cで解凍します(基底膜マトリックスを温めないでください、そうしないと固まります)。1mLのアリコートを調製し、-20°Cまたは-70°Cで保存します。
2. 基本的な線維芽細胞増殖因子(bFGF)を滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で10 μg/mLで再構成し、10 μLのアリコートを調製します。4°Cで保存してください。
3. グルタミンを含む新しい未開封のDMEM/F12の500 mLボトルに、B27(10 mL)、N2(5 mL)、およびペニシリン-ストレプトマイシン(5 mL)を加えます。.この神経幹細胞(NSC)培地50 mLをコニカルチューブに入れ、10 μLの10 μg/μL(最終2 μg/mL)bFGFを加えます。NSC(+)bFGF培地は4°Cで保存します。
4. (-)bFGF培地を作成するには、ステップ1.3で説明したのと同じレシピを使用しますが、bFGFは追加しないでください。この培地は、NSCをニューロンに区別し、分化後のニューロン培養を維持するために使用されます。

2. レンチウイルスコンストラクト

注:レンチウイルスコンストラクトの使用を開始する前に、ラボがバイオセーフティレベル2(BSL-2)エージェントの使用が承認されていることを確認してください。さらに、レンチウイルスベクターを取り扱う際には、BSL-2培養フード、個人用保護具(PPE)、および廃棄方法を使用する必要があります。

1. レンチウイルスにパッケージ化されたタウコンストラクトを好ましい供給源から入手します。

3. ヒト神経幹細胞の培養

注:NSCは通常、100,000〜150,000細胞/cm²で播種され、ほとんどの市販のNSCは1 x 10⁶細胞/バイアルとして販売されています。このプロトコルは、10 cmの細胞培養ディッシュ用に最適化されています(ただし、他のサイズのディッシュを使用することもできます)。したがって、市販のNSCを使用している場合、10cmのディッシュに十分な細胞を播種するのに十分な細胞を得るために、まず6ウェルシャーレでNSCを培養してNSCを増殖させる必要があるかもしれません。このプロトコールは、あるいは、さまざまな細胞培養ディッシュサイズに適合させることができます。

1. 細胞培養プレートの調製には、細胞培養プレート用の凍結基底膜マトリックスコーティングのアリコートを1つ取り除き、4°Cで解凍します(アリコートは、細胞を播種する前日に一晩4°Cで置くことができます)。385 μL の基底膜マトリックスコーティングを 5 mL の DMEM/F12 培地 + ペニシリン-ストレプトマイシン
   に加えます。 注:5 mLのDMEM / F12培地+ペニシリン-ストレプトマイシンは、1つの10 cmディッシュをコーティングするのに十分です(この基底膜マトリックスコーティング溶液1 mLは、6ウェルディッシュの1ウェルをコーティングするのに十分です)。あるいは、細胞を固定して免疫染色するか、またはチオフラビンを染色する場合は、24ウェル培養皿のガラスカバースリップで細胞を培養します。
   1. 培地とマトリックスコーティングを培養皿に加える前と加える間は、冷たく保ってください。培養皿に基底膜マトリックスコーティングを添加し、培養皿をインキュベーター(37°C)に1時間置きます。最適なコーティングのために、基底膜マトリックスを1時間以上または1時間未満インキュベートしないでください。1時間後、細胞培養皿から基底膜マトリックスコーティングを吸引します。これがNSCがメッキの準備ができていることと一致していることを確認してください.
      手記：凍結ストックから細胞が解凍されていない場合は、ステップ3.2をスキップしてステップ3.3に進みます。
2. 凍結したNSCストックから細胞を解凍する場合は、凍結した細胞のバイアルを取り、バイアルを水中で前後に動かして37°Cに加熱した水浴で温めます。解凍したら、バイアルに70%エタノールをスプレーし、細胞培養フードに入れます。細胞を~10 mLのDMEM/F12 + ペニシリン-ストレプトマイシン培地に移し、チューブを室温で1,000 x gで5分間遠心分離します。培地を吸引し、細胞をNSC培地に再懸濁します。
3. NSC培地で細胞を希釈して、使用している細胞培養容器に適した播種密度を得ます。
   手記：例えば、NSCを6ウェルプレート(6ウェル培養皿の1ウェルの表面積が9 cm²)に播種する場合、播種には900,000〜1,350,000個の細胞が必要です。したがって、1,000,000個の細胞を含む1つのバイアルを2 mLの培地に再懸濁し、6ウェルディッシュの1つのウェルに加えることができます。
4. NSC培地に懸濁した細胞を十分に添加し、基底膜マトリックスコーティング培養皿(100,000細胞/^cm2)に播種し、1日おきに培地を交換します(凍結ストックを使用する場合は、めっきの翌日とその後1日おきに培地を交換してください)。細胞が75%〜80%のコンフルエントになるまで細胞を成長させます.
   手記： 細胞はプレーティング後すぐに75%〜80%のコンフルエンスに達する可能性がありますが、凍結ストックを使用すると、これにさらに時間がかかる可能性があります。
5. NSCが75%〜80%コンフルエントになったら、NSC(+)bFGF培地を取り出してNSC(-)bFGF培地に置き換えることにより、ニューロンの分化を開始します。この培地で細胞を培養し(1日おきに培地を交換します)、少なくとも4週間
   手記： 細胞は、bFGFの回収後数日間分裂し続けます。したがって、細胞は90〜100%のコンフルエントに達する可能性があります。
6. 4週間培養した後、細胞はニューロンの運命を達成し、レンチウイルスの治療の準備が整います。

4. 神経細胞培養の形質導入と維持

1. レンチウイルスでニューロンを形質導入するには、力価カウント3.4 x 10⁵形質導入可能単位/細胞を使用します(100%コンフルエントな10cmディッシュには~1,000万個のニューロンが含まれます)。形質導入可能な単位を細胞培養培地中の必要な濃度に希釈し、細胞に添加します(細胞培養皿には通常容量の培地を使用します)。レンチウイルスを添加した2日後、細胞を新鮮な(-)bFGF培地(レンチウイルスなし)で1回洗浄し、通常通り(-)bFGF培地で培養を続けます。
2. レンチウイルス後治療では、細胞培養培地([-]bFGF培地)を隔日で交換することにより、形質導入されたニューロンに栄養を与えます。形質導入後~8週間細胞を維持します。生存率を確認するために、光学顕微鏡で細胞を定期的に視覚化します.
   手記：まばらさや樹状突起の破損は、細胞が生存できなくなった兆候です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10cmカルチャーディッシュ	サーモフィッシャー	12556002
50 mLチューブ	バイオパイオニア	CNT-50
エタノール70%スプレーボトル	さまざまなソース	NA
B27サプリメント	サーモフィッシャー	17504044
基底膜マトリックス(マトリゲル)	コーニング	356231
基本的なFGF	バイオパイオニア	HRP-0011
ウシ血清アルブミン	シグマ	A7906
細胞培養インキュベーター	さまざまなソース	NA
遠心分離機	さまざまなソース	NA
DMEM-F12 グルタミン入り培地	サーモフィッシャー	10565042
エタノール(濃度50%以上)	さまざまなソース	NA
ヒト神経幹細胞	さまざまなソース	NA
レンチウイルスベクター	各種ソース	カスタムオーダー
N2サプリメント	サーモフィッシャー	17502048
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140122
リン酸緩衝生理食塩水	サーモフィッシャー	14190250
無菌細胞培養フード	さまざまなソース	NA
ウォーターバス	さまざまなソース	NA