自家血液注射によるくも膜下出血ラットモデルの確立

要約

出典:Bömers, J. et al. Pre-Chiasmatic, Single Injection of Autologous Blood to Induce Experimental Barbacunoid Hemorrhage in a Rat Model. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、くも膜下出血ラットモデルを確立する手順を示しています。麻酔をかけたラットにプローブを埋め込み、頭蓋内圧と脳血流を測定します。標的部位が特定され、針が視交叉前位置に挿入されます。その後、くも膜下腔に自家血液を注入し、頭蓋内圧を上昇させ、脳血流を減少させ、モデルを確立します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1です。事前準備

1. 挿管用に16Gの末梢静脈カテーテルを改造します。変更するには、針を1 cm短くし、残りの遠位を注入バルブに向かって1 cm x 30°曲げます。カテーテルウィングを取り外します(複数回使用します)。
2. 頭蓋内圧プローブまたはICPプローブを作成するには、20mmのポリエチレンチューブ(内径(ID):0.58mm、外径(OD):0.96mm)を切断し、一端を燃焼させて円形のプレートを作り、内腔を開いたままにします。ポリエチレンチューブを1mmのシリコンチューブ(内径:1.0mm、外径:3.0mm)で迂回してから、10mmのシリコンチューブ(内径:0.76mm、外径:2.4mm)をポリエチレンチューブの端に接続します。
3. ラップトップの電源を入れ、データ収集ソフトウェアを開きます。製造元の指示に従って、血圧(BP)および脳内圧(ICP)トランスデューサーとレーザードップラーを校正します。
4. 血液ガス分析装置を準備します。
   注意:気化器に十分なイソフルランがあることを確認してください。
5. O₂と大気の流れをオンにします。O₂ の流量を30%、大気の流量を70%に設定します。
6. 加熱パッドを置き、温度を37°Cに設定します。

2です。麻酔

1. ラットをO₂ の30%と大気の70%の流れで麻酔室に入れます。5%のイソフルランガスをチャンバーに投与します。適切な麻酔には約4分かかります。呼吸を慎重に制御します。
2. 麻酔をかけたら、輪ゴムで迂回した重いプレートの上にラットを仰臥位に置きます。.ラットの前歯を輪ゴムの下に置きます。
3. 湾曲した鉗子で舌を丁寧に引き出します。綿の先端で喉頭を清掃します。喉の正中線に外部光を配置して、声帯を視覚化します。
4. 改良された 16 G 末梢静脈カテーテルを使用して吸気中に挿管します。正しく挿入されたら、スティレットを取り外します。カテーテルを人工呼吸器に接続します。
   注:チューブの正しい配置は、呼吸数と同期した胸の動きによって確認されます。腹部の動きが見られる場合は、ラットを抜管して麻酔ベルに再導入します。気道を損傷するリスクがあるため、手順を3回以上繰り返さないでください。
5. 挿管された動物は、O₂ の30%と大気中の70%の人工呼吸を続けてください。麻酔をイソフルランの1.5%〜3%に維持します。血圧を80〜100 mmHgに保つようにイソフルランを調整します。
6. 人工呼吸器の吸気量を3mLに、周波数を40〜45回吸気/分に保ちます。血液ガス分析に応じて吸気量を調整します。
7. 2-0縫合糸で頬の内側の軟部組織に縫い目を入れます。注射管と末梢静脈カテーテルの注入弁の周りに縫合糸を結び、カテーテルを固定します。
8. ラットを手術野に移動し、尾を外科医に向けて仰臥位に置きます。
9. ドライアイに対抗するために、必要に応じてアイジェルを塗布します。
10. つま先をつまんで、適切な麻酔の深さを確認します。手術中の麻酔の深さを評価し、維持します。

3です。テールカテーテル

1. 尾の近位3〜4 cmを0.5%のクロルヘキシジンエタノールで消毒します。
   注: これからは、外科医の判断で手術用顕微鏡を使用してください。
2. 腹側の尾の近位端に15〜20mmの皮膚切開を行います。動脈を切開しないように注意してください。
3. 湾曲した鉗子を使用して、下にある結合組織から皮膚を緩めます。
4. 動脈を露出させる筋膜を慎重に貫通します。
5. 湾曲した鉗子を使用して、尾動脈を下にある組織から慎重に解放します。
6. 3本の黒い絹糸を容器の下に滑り込ませます。1本の糸をできるだけ遠位に置き、動脈の周りに外科的結び目をしっかりと結びます。糸の緩い端を止血器で保持します。
7. 残りの2本の糸を動脈の周りにゆるく結びます。
8. 近位糸をできるだけ近位に押します。近位糸の端を保持するために止血剤を適用します。止血剤を軽く引っ張りますが、血流を制限して遮断するのに十分です。止血器を腹部に置きます。
9. カテーテルの先端を45°の角度で切断します。動脈壁の貫通を防ぐために鋭利な先端をカットします。
10. Vannasハサミを使用して、遠位結び目から3〜5 mmのところに、動脈の直径の1/3を30°の角度で動脈切開します。
11. 2つのまっすぐな鉗子を使用してカテーテルを動脈に挿入します。一方の鉗子を使用してカテーテルを保持し、もう一方の鉗子を使用して動脈をカテーテルの上に慎重に引っ張ります。
12. カテーテルを血管の近位結び目に挿入し、止血剤の結び目を緩めます。カテーテル内の血流を可視化します。真ん中の糸をカテーテルにゆるく固定します。
13. 動脈が再び筋膜で覆われるポイントまで、可能であればそのすぐ先まで挿入を続けます。.
14. カテーテルの配置と漏れの可能性を生理食塩水で洗い流すことで制御します。
15. 外科用結び目を使用して2つの近位糸を固定します。
    注: 血圧測定は脈動性である必要があります。そうでない場合、カテーテルは適切に配置されていません。
16. 遠位糸を使用して外科的結び目を結ぶことにより、切開部の端にカテーテルを固定します。
17. 皮膚の切開部を2つの非吸収性モノフィラメント4-0縫合糸でゆるく縫い合わせます。カテーテルを貫通しないように注意してください。
    注:手術中は、脈動の振幅に注意してください。これが低い場合は、カテーテルを生理食塩水で洗い流します。
18. 圧力トランスデューサーから動脈カテーテルを緩めて、血液ガスサンプリングのための血流を確保します。カテーテルの端にマイクロキャピラリーチューブを配置します。血液をチューブに流します。採血後、カテーテルをトランスデューサーに再度取り付け、カテーテルを洗い流します。
19. 毛細血管チューブを血液ガス分析装置に挿入します。pH、pCO₂、pO₂を測定し、それらをメモします
    注: 血液ガスと血圧の値に応じて、換気率を変更してください。平均動脈圧(MAP)が低すぎる場合は、イソフルランの流量を下げてみてください。反射神経をテストして、麻酔の適切な深さを確認します。

4. ICPプローブ

1. ラットを定位固定装置フレームに置きます。ラットを対称的に配置することが重要です。
2. 定位固定装置フレームの下に円筒形の枕を置き、首の前方屈曲を作成します。
3. ネズミの頭皮、首、耳の後ろの部分を剃ります。余分な髪を取り除きます。
4. 0.5%のクロルヘキシジンエタノールでその領域を消毒します。
5. アドレナリンを含む0.7 mLの10 mg / 5μg / mLリドカインで局所麻酔をかけ、正中線の頭蓋骨の尾側端に針を挿入します。.首の筋肉組織に0.3〜0.4mLを注入します。残りをブレグマの周囲と前方に皮下注射します。.
6. 針の穿刺から正中線の尾側~8mmの皮膚を切開します。
7. すべての筋肉を層状に鈍く解剖して、大動脈後頭膜(正中線の頭蓋骨の尾側にある大理石色の三角形)を特定します。
8. Almリトラクターを使用して、首の筋肉組織を拘束します。必要に応じて、プロングリトラクターを尾側に配置します。
9. 滅菌ICPプローブがICPトランスデューサーに接続されているか確認してください。ICPプローブを生理食塩水で洗い流します。ICPプローブに気泡が存在しないことを確認します。
10. 23Gの針を使用して大動脈後頭膜を切開します。ICPプローブをメンブレンに通すための穴を開けます。
11. プローブを大動脈後頭膜にそっと通します。プローブを軽く引っ張り、0〜5mmHgの範囲の脈動曲線を示していることを確認します。そうでない場合は、プローブを取り外し、トランスデューサーへの接続を確認して、ルーメンを通る流れを確認します。
12. ティッシュ接着剤を2滴塗ります。1 mmシリコンチューブをメンブレンまで前方に移動し、ICPプローブの変位のリスクを最小限に抑えるために追加の接着剤を塗布します。
13. リトラクターを取り外します。
14. 切開部の頭側端に水平マットレス縫合糸を 1 つ作成し、非吸収性モノフィラメント 4-0 縫合糸を使用して尾側端に 1 つの単純な中断縫合糸を作成します。

5. 針とレーザードップラープローブの配置

1. 正中線を目のすぐ前、尾側に15mm切開します。
2. 結合組織と筋肉を鉗子で取り除きます。滅菌綿棒の端をルージンとして使用し、ブレグマと冠状縫合糸の識別を可能にします。
3. Almリトラクターを配置します。
4. 25Gの脊髄針を脳定位固定装置フレームに留置します。針をブレグマに正確に配置し、位置をメモします。
   注:定位固定装置フレームの正中線ジョイントを、垂直面の動物に向かって30°の位置に配置します。
5. ブレグマから針を取り外し、フレームを65 mm前方に移動し、次に正中線で針を交換して穴あけ部位をマークします。
6. 硬膜が骨の下に特定されるまでドリルします。まっすぐな鉗子を使用して骨片をそっと取り除き、空洞を骨ワックスで満たします。
7. ブレグマの右側に3〜4 mm横に、レーザードップラー用の冠状縫合糸のすぐ前方に別の穴を開けます。骨全体に穴を開ける必要はありません。硬膜に浸透しないように注意してください。
8. レーザードップラーが血流を測定できる血管を探します。レーザードップラーを配置し、値を確認します。100 FU の最小値が必要です。顕微鏡(人工光)を取り外します。
9. それでも値が許容できる場合は、接着剤を1滴追加してプローブを固定します。
10. 値が 80 FU を超えているかどうかを再確認してください。値が80 FU未満の場合は、プローブを取り外して位置を変え、80 FUを超える値に到達します。
    注: 値 FU は、脳血流 (CBF) を示す任意の単位です。

6. くも膜下出血(SAH)の誘発

1. 頭蓋骨の基部の抵抗が感じられるまで、半球間の正中線で頭蓋骨に針をそっと挿入します。針を1mm引っ込めて、視交叉のすぐ前方に正しく配置されるようにします。
2. 針を時計回りに90°回して、針の先端が右を向くようにして、血液を注入するときに最も均質な結果が得られるようにします。スティレットを取り外します(図1)。
3. 15分間平衡化し、麻酔のレベルを調整して、平均動脈血圧を80〜100mmHgの範囲にします。
4. 血液ガス分析を実行します。それに応じて麻酔のレベルを調整します。
5. 鈍い23G針を備えた1mLシリンジを使用して、テールカテーテルから500μLの血液を引き出します。
6. 脊髄針室のデッドスペースを血液で満たし、空気の注入を避けます。血液を充填したシリンジから23Gの針を取り出し、シリンジに300μLの血液が含まれていることを確認します。
7. シリンジを脊椎針に接続します。しっかりとつかみ、手動で血液を注入してMAPを超えます。
8. ラップトップでは、ICP の急激な上昇と CBF の急激な低下を観察します。
   注: CBFは、手術が成功するためには、少なくとも5分間、ベースラインスコアと比較して50%以下である必要があります(図2を参照)。偽ラットはステップ6.1-6.7を経ないため、脊髄針の大脳への導入が省略され、自然出血の可能性と医原性脳損傷が最小限に抑えられます。

結果

図1:SAH導入前のセットアップの概要。写真の上から、1)インジェクションニードル、2)レーザードップラープローブ、3)ICPプローブがすべて所定の位置にあることに注意してください。

図2:髄腔内注射後のサンプルトレース。赤いグラフはmmHg単位の血圧を示しています。青色のグラフはICPをmmHgで、緑色のグラフは任意の単位FUでCBFを示しています。ICPの急上昇は、血液注射の結果です。これにより、CBF >ベースラインの 50% 以上が 5 分以上低下することに注意してください。さらに、I...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16 G末梢静脈カテーテル	BDベンフロン	393229	針は短く、遠位は1cm湾曲しています。翼を削除
麻酔ベル/チャンバー	不明
血液ガス分析装置	放射 計	ABL80
血圧(BP)モニター	アドインストゥルメンツ	ML117	Powerlabに接続
湾曲鉗子、12cm×3	F.S.T(エフエスティー)	11001-12	麻酔用
円筒形枕、28 cm x 4 cm	ホームメード		サージカルタオルから作られ
データ集録ハードウェア	アドインストゥルメンツ	ML870 パワーラボ
データ取得ソフトウェア	アドインストゥルメンツ	Labチャート6.0
ドリル	KMDの	1189
ドリルコントローラー	シルフラデント	300インチ
フレキシブルライト	ショット	KL200
ヒーティングパッド	ミンコ	1135
皮下注射針、20 g	KDメディカル	301300	脳定位固定装置フレームに接続
ICPモニター	アドインストゥルメンツ	ML117	Powerlabに接続
イソフルラン気化器	大梅田	TEC3
ラップトップ	レノボ	T410
レーザードップラーモニター	アドインストゥルメンツ	ML191
レーザードップラープローブ	オックスフォード・オプトロニクス	MSF100XP	レーザードップラーモニターに接続
ニードルホルダー, 13 cm	F.S.T(エフエスティー)	12001年13	麻酔用
精密シリンジ、0.025 mL	ハミルトン	547407
脳定位固定装置用フレーム	コップフ・インスツルメンツ	M900
手術用顕微鏡	カールツァイス	F170
縫合針	オールガイアー	1245	麻酔用
温度コントローラー	CWE株式会社	TC-1000
トランスデューサー×2	アドインストゥルメンツ	MLT0699	BPおよびICPモニターに接続
人工呼吸器	ウーゴバジーレ	7025
動物用バリカン	エイスクラップ	GT421
ブレアリトラクター3本, 13.5 cm	アグントス	17022--13
ブラントアルムリトラクター	F.S.T(エフエスティー)	17008-07
湾曲鉗子、12 cm x 2	F.S.T(エフエスティー)	11001-12
ニードルホルダー, 13 cm	F.S.T(エフエスティー)	12001年13
ストレートデュモン鉗子、11 cm	F.S.T(エフエスティー)	11252から00
ストレートハルステッド-モスキート止血器x2	F.S.T(エフエスティー)	13008-12
ストレートアイリスハサミ, 9 cm	F.S.T(エフエスティー)	14090から09
ストレートバンナスハサミ、10.5 cm	F.S.T(エフエスティー)	15018-10
アブソープ可能な綿棒	ケッテンバッハ	31603
黒絹糸、4-0、5 x 15 cm	Vömel	14757
ボーンワックス	エイスクラップ	1029754
カルボマーアイジェル2mg / g	パラノヴァ
綿棒	ハインツ・ヘレンツ	WA-1
コットンチップアプリケーター×4	セレファ	120788
皮下注射針、23G x2	KDメディカル	900284	活栓に接続します。遠位端を取り外す
皮下注射針、23G x3	KDメディカル	900284	遠位端を取り外し、2つはストップコックに、1つはシリンジに接続します
ICPプローブ:	ホームメード		次のもので構成されています。
ポリエチレンチューブ、20 mm	スミスメディカル	800/100/200	内径(ID):0.58mm、外径(OD):0.96mm。
シリコンチューブ、10 mm	漁夫	15202710	ID:0.76 mm、OD:2.4 mm。
シリコンチューブ、2 mm	漁夫	11716513	ID:1.0 mm、OD:3.0 mm。
マイクロヘマトクリットチューブ	ブランド	7493 11
OPタオル, 45 cm x75 cm	メルンリッケ	800430
PinPort アダプタ、22 G	インステック	PNP3F22
PinPortインジェクター	インステック	PNP3Mの
ポリエチレンチューブ、2 x 20 cm	スミスメディカル	800/100/200	シリンジに接続します。ID:0.58 mm、OD:0.96 mm。
ラバーバンド	不明
メス、10ブレード	キアト	23110
脊椎針、25 G x 3.5インチ	ブラウン	5405905から01
ストップコックシステム ディスコフィックス x 2	ブラウン	16494C	トランスデューサーに接続
縫合糸、4-0、モノフィル、非吸収性×3	エチコン	EH7145H
シリンジ、1 mL	BDプラスティパック	1710023
シリンジ、ルアーロック、10 mL x 4	BDプラスティパック	305959	トランスデューサーに接続
ティッシュ接着剤	3メートル	1469SBの
0.5%クロルヘキシジンスピリット	ファーボルグファーマ	210918
カルプロフェン50 mg / mL	スキャン獣医	43715	希釈 1:10
イソフルラン	バクスター
等張性生理食塩水	アングロス	16404
リドカイン-アドレナリン10 mg / 5μg / mL	アングロス	16318

の の ました 名 年 の の 月 の 名 名 型 月