フローサイトメトリーを用いたニューロンにおける複数のミトコンドリアパラメータの測定

要約

出典:Liang, K. X., et al. Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体、ミトコンドリアDNA関連タンパク質、ミトコンドリア外膜タンパク質に対する抗体でニューロン細胞を標識し、その後、フローサイトメトリーでそれらのレベルを定量化する方法を示します。

プロトコル

1. 固定細胞におけるMRC(ミトコンドリア呼吸鎖)複合体サブユニットとTFAM(ミトコンドリア転写因子A)のフローサイトメトリー測定

1. 培養期間の終わりに、細胞解離試薬を添加して細胞を剥離(~10⁶)し、その後、ペレット化して細胞を15mLチューブに集めます。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(1x)で300 × gで5分間遠心分離することにより、細胞を2回遠心分離して細胞を洗浄します。
2. 1.6%パラホルムアルデヒド(PFA)(15mLチューブ中の1.6%PFA1 mL)に細胞を室温(RT)で10分間固定し、PBS(1x)で300 × gで5分間遠心分離することにより、PBS(1x)で2回遠心分離して細胞を洗浄します。
3. 氷冷した90%メタノール(15 mLチューブ中の90%メタノール1 mL)を-20°Cで20分間細胞に浸透させます。
4. 0.3 Mグリシン、5%ヤギ血清、および1%ウシ血清アルブミン(BSA)-PBS中のフラクションVを含むブロッキングバッファー(1x)(15 mLチューブに1 mLのブロッキングバッファー)でサンプルをブロッキングします。PBS(1x)で2回遠心分離して細胞を洗浄します。
5. 複合体Iサブユニットの測定用の抗NDUFB10(1:1,000)、複合体IIサブユニットの測定用の抗コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体フラビンタンパク質サブユニットA(SDHA、1:1,000)、複合体IVサブユニットの測定用の抗COX IV(1:1,000)、Alexa Fluor 488(1:400)と結合した抗TFAM(ミトコンドリア転写因子A)抗体と30分間インキュベートします。Alexa Fluor 488 (1:400) と結合した抗 TOMM20 抗体 (ミトコンドリア外膜 20 トランスロカーゼ) で同数の細胞を別々に染色します (15 mL チューブに 1 mL の一次抗体溶液を注入します。抗体の詳細については、材料表を参照してください)。
6. 細胞をPBS(1x)で1回、300 g×遠心分離して5分間洗浄し、二次抗体(1:400)をNDUFB10、SDHA、およびCOX IVのチューブに加え、これらの溶液で細胞を30分間インキュベートします。
7. 細胞をPBS(1x)で1回、300 g× gで5分間遠心分離し、上清を吸引し、チューブ内に約100 μLを残します。細胞ペレットを300 μLのPBS(1x)に再懸濁します。細胞を氷上の暗所に置いた1.5mLの微量遠心チューブに移します。
8. フローサイトメーター(青色レーザー3個、赤色レーザー1個構成)で細胞を解析します。530/30 バンドパス フィルターを使用して、フィルター 1 (FL1) の信号を検出します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Alexa Fluor 488	アブカム	ab198308	一次抗体;1000 μL染色溶液中の1:400, 2.5 μLとして使用してください。アイソタイプコントロールとしてマウスモノクローナルIgG2b Alexa Fluor® 488を使用してください。
反TOMM20とAlexa Fluor 488	サンタクルスバイオテクノロジー	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	一次抗体;1000 μL染色溶液中の1:400, 2.5 μLとして使用してください。アイソタイプコントロールとしてマウスモノクローナルIgG2a Alexa Fluor® 488を使用してください。
アンチNDUFB10	アブカム	ab196019	一次抗体;1:1000, 1 μL の染色液中で 1:1000, 1 μL として使用します。Alexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgG(1:400、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11008)を二次抗体として使用する。ウサギモノクローナルIgGをアイソタイプコントロールとして使用します。
反SDHA	アブカム	ab137040	一次抗体;1:1000, 1 μL の染色液中で 1:1000, 1 μL として使用します。Alexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgG(1:400、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11008)を二次抗体として使用する。ウサギモノクローナルIgGをアイソタイプコントロールとして使用します。
反COX IV	アブカム	ab14744, RRID:AB_301443	一次抗体;1:1000, 1 μL の染色液中で 1:1000, 1 μL として使用します。Alexa Fluor ® 488ヤギ抗マウスIgG(1:400、Thermo Fisher Scientific、カタログ#A-11001)を二次抗体として使用します。アイソタイプコントロールとしてマウスモノクローナルIgGを使用します。
PBS 1倍数	サーモフィッシャーサイエンティフィック	18912014	洗濯ステップに使用
ホルムアルデヒド (PFA) 16%	サーモフィッシャーサイエンティフィック	28908	細胞固定
グリシン	シグマ・アルドリッチ	G8898	ブロッキングバッファ
ウシ血清アルブミン	エウロパ・バイオプロダクツ	EQBAH62-1000	免疫染色アッセイおよびCDM成分における抗体の非特異的結合を防止するブロッキング剤

と組み合わせた反TFAM抗体 の併用 で使用