モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

Summary

我々は、モデルヘルペスウイルス、ガンマヘルペスウイルス68（γHV68）の溶菌複製における宿主シグナル伝達分子の重要な役割を識別するためのプロトコルを記述します。 γHV68溶菌レプリケーション用に遺伝子改変されたマウス系統と胎児線維芽細胞を利用して、プロトコルは、表現型の特徴とウイルス溶解複製におけるウイルス - 宿主相互作用の分子尋問の両方を可能にします。

Abstract

ウイルス感染に応答して、ホストがそのような抗ウイルスサイトカイン産生の^1,2につながる自然免疫シグナル伝達経路を活性化するなど、様々な防御的な応答を、開発しています。ホストを植民地化するためには、ウイルスは、宿主の抗ウイルス応答を回避し、シグナル伝達経路を操作することが嫌気されています。宿主ウイルス相互作用を解明することはウイルス感染に対する新たな治療戦略の開発に光を当てることになります。

ネズミγHV68は密接に人間の発癌性カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスとEpsten-Barrウイルス^3,4に関連しています。実験用マウスでγHV68感染はヒトヘルペスウイルスでは利用できませんin vivoにおける宿主応答とウイルス感染、の全過程を調べるために扱いやすい小動物モデルを提供します。このプロトコルでは、表現型の特徴とγHV68溶菌replicでホストシグナル伝達成分の分子解剖のための方法のパネルを提示vivoおよび ex vivoの両方において ation。遺伝的に改変されたマウス系統の有用性は 、in vivo で γHV68急性感染時に宿主シグナル伝達経路の役割の尋問を許可します。さらに、これらの欠損マウス系統から単離されたマウス胚線維芽細胞（MEF）を、さらにγHV68溶菌複製を ex vivoでの間にこれらの分子の役割を分析するために使用できます。

ウイルス学的および分子生物学的アッセイを用いて、我々はホストウイルスの相互作用の分子機構を特定し、ウイルス溶解複製に必須のホストおよびウイルス遺伝子を特定することができます。最後に、細菌人工染色体（BAC）システムは、具体的にホストウイルス作用を中断ウイルス因子（複数可）への変異の導入を容易にします。これらの変異を有する組換えγHV68は主要なホストシグナル伝達成分が欠損したMEFにおけるγHV68溶菌複製の表現型を再現するために使用できます。このプロトコルは 、in vivo および ex vivo における介入の複数のレベルで宿主-病原体相互作用を調べるための優れた戦略を提供しています。

最近、我々はγHV68奪う自然免疫シグナル伝達経路は、ウイルス溶解複製^5を促進することを発見した。具体的には、γHV68de novoの感染症は、免疫キナーゼIKKβを活性化し、活性化IKKβは、ウイルスの転写活性化を促進するために、マスターウイルスの転写因子、複製およびトランス（RTA）をリン酸化する。そうすることで、効率的にγHV68カップルの自然免疫活性化をホストするために、その転写活性化は、それによってウイルス転写および溶解複製を容易にする。この研究では、ホスト·ウイルスとの相互作用を調べるために他のウイルスに適用できる優れた例を提供しています。

Protocol

1。 γHV68によるマウス感染

1. 6〜8週齢、性別をマッチさせた同腹マウス（8〜12匹/群）ウイルス感染のために使用されます。マウスは出荷後4日間フル（96時間）の上に順応することができます。
2. ウイルスを使用してプロトコルの手順は標準BSL2予防措置を用いてバイオセーフティレベル2（BSL2）のキャビネットで行うべきである。
3. ただの実験の前に、マウスあたりの滅菌PBS30μlのγHV68のウイルス懸濁液（40〜1×10 ⁵プラーク形成単位[PFU]）を準備します。氷の上でウイルス懸濁液を保管してください。
4. マウスの鎮静をケタミン/キシラジン溶液（1.5 mgのケタミンおよび0.15 mg xylazine/20 g体重、100μL/マウス）を準備します。マウスはつま先のピンチを行うことにより、鎮静されていることを確認します。
5. 1.5mgのケタミンおよび腹腔内注射で20 mgの体重当たり0.15ミリグラムのキシラジン（100μL/マウス）と落ち着いたマウス。
6. 滴下には、鼻腔内にウイルス懸濁液（30μL/マウス）を提供鎮静マウスの一方の鼻孔にファッション、。
7. 5用に片側にマウスを置き - 10分肺にウイルスの気道送達を容易にする。
8. 背面ケージとモニター、マウスで場所マウス、彼らが完全に鎮静状態から回復したまで。
9. 各種日間感染後に、肺の深い意識の....

Discussion

ウイルス感染に応答して、MAVS依存自然免疫シグナル伝達経路は^{、10月14日}抗炎症性サイトカインの産生を促進するために活性化されています。人間の発癌性カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスおよびエプスタイン-バーウイルス^3,4のモデルウイルスとしてマウスγHV68を使用して、我々はγHV68横取りMAVS-IKKβ経路は転写活性化^5を介してウイルス溶解複製を促進することを発見した。分子ウイルス学における遺伝的に修飾されたMEFと技術を用いた、このプロトコルはγHV68溶菌複製にとって重要な特定の経路のシグナル伝達成分を効率的に識別することができます。このように、このプロトコルは 、in vivo感染、ex vivoで溶菌複製、自然免疫シグナル伝達経路の解剖に必然的に伴う。組換えヘルペスを生成する細菌人工染色体を含む分子機構、追加の手順を記述するためにウイルスと分子生物学的実験が必要である。さらに、ノックアウトマウス系統と線維芽細胞は、これらの実験のための鍵となります。利用可能なノックアウトマウス系統の数が多​​いと、このプロト.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号
リポフェクタミン2000	インビトロジェン	11668-019
エレクトロポレーションMAXのコンピテントセル	インビトロジェン	18290-015
メチルセルロース	シグマ	M0512
POWERPREP HPプラスミドミニシステム	OriGene	NP100004
POWERPREP HPプラスミドミディプレップシステム	OriGene	NP100006