ヒト細胞におけるγ-セクレターゼ活性を測定するためのルシフェラーゼアッセイ

要約

出典:Wang, B., et al., 細胞ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイプラットフォームにおけるγ-セクレターゼ媒介性アミロイド前駆体タンパク質およびノッチ切断の定量的測定。J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、テトラサイクリン誘導システムを使用して、遺伝子組み換えヒト細胞のγ-セクレターゼ活性を測定する手順を示しています。このプロセスには、テトラサイクリンによるAPP遺伝子発現の誘導、アミロイドβペプチドの生成、およびルシフェラーゼ産生の活性化が含まれます。次に、ルシフェラーゼ-基質反応から生じる生物発光を測定し、γ-セクレターゼ活性を反映します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. APP-C99(アミロイド前駆体タンパク質 - C末端99アミノ酸断片)のγ-セクレターゼ切断に対応するルシフェラーゼレポーターシグナルの測定

注:CG(C99-Gal4)細胞の生成に関する詳細な説明については、以前の資料を参照してください。

1. CG細胞(20, 000細胞/ウェル)を、最終容量200 μL/ウェルの96ウェルマイクロプレートに播種し、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)と10%ウシ胎児血清(FBS)、5 μg/mLブラストシジン、250 μg/mL抗生物質(ゼオシンなど)、および200 μg/mLハイグロマイシンBからなる増殖培地で調製します。
   1. 血球計算盤で細胞をカウントします。
   2. マイクロプレートを加湿した_CO2インキュベーターに移し、37°Cで一晩インキュベートします。
2. 各ウェルから100 μLの増殖培地を取り出します。
3. 2 μg/mLテトラサイクリンを含む増殖培地100 μL/ウェルに、0.2%ジメチルスルホキシド(DMSO)、2 μM CL-387,785、2 μM N-[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル-L-アラニル)]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステル(DAPT)、またはその他の関連ErbB1/ErbB2阻害剤を加えます。
4. 処理したCG細胞をマイクロプレートで37°Cで24時間インキュベートします。
5. 150 μL/ウェル増殖培地をマイクロプレートから取り出します。
6. 50 μL/wellのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加します(材料表を参照)。
7. マイクロプレートを発光マイクロプレートリーダーに移します。
   1. マイクロプレートを室温で5分間、穏やかに攪拌しながら維持します。
8. 発光マイクロプレートリーダーに保存されている事前定義されたプログラムを使用して、Fireflyルシフェラーゼ(FL)発光を決定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ビクターライト 発光プレートリーダー	パーキンエルマー	2030-0010
クラスII、タイプ2生物学的安全キャビネット	サーモサイエンティフィック	1300 シリーズA2
CL-387,785	EMDカルバイオケム	233100-1MG
DAPT	メルク	565770
ダルベッコ モディファイド イーグル ミディアム (DMEM)	サーモフィッシャー	12100046	成長培地の主な構成要素
ウシ胎児血清(FBS)	サーモフィッシャー	16000044
ブラストシジン	サーモフィッシャー	A1113903
ゼオシン	サーモフィッシャー	R25005
ハイグロマイシンB	ギブコ	10687010
血球計算量計	シグマ・アルドリッチ	BR717805 アルドリッチ
96ウェルマイクロプレート	ヌンク	156545
テトラサイクリン	シグマ	T7660
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ	D2650
Steady-Glo ルシフェラーゼアッセイ試薬	プロメガ	E2510
加湿式CO2インキュベーター	レヴコ	ウルティマII
T-REx293細胞株	インビトロジェン	R71007
Wallac 1420ソフトウェアバージョン3.0	パーキンエルマー		発光マイクロプレートリーダーの装置制御ソフトウェア