マウス脳切片における座骨髄領域を同定するための免疫組織化学

要約

出典:Schmidt, K. et al., マウス脳におけるLocus coeruleusの局在化。J. Vis. Exp. (2019)

このプロトコルは、マウス脳切片の青斑核領域を特定するための免疫組織化学の使用について概説しています。ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼを緑色蛍光色素標識抗体で標的とすることにより、ノルエピネフリン産生ニューロンは顕微鏡下で緑色蛍光として可視化されます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. ブレイン・スライシング

1. マウスを固定し、3%イソフルランを適用して麻酔します。
   1. 綿球にイソフルランを滴下して浸し、15mLの微量遠心チューブに入れます。動物の鼻をチューブに入れ、イソフルランを吸い込むようにします。つま先をつまむことに対する反応の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
2. 動物を仰向けに置き、腹部にアクセスしながら四肢をTピンで固定して固定します。
3. 手術用ハサミで動物を切断し、腹部の皮膚を切り取り、胸部の皮膚を切り裂きます。Tピンを使用して皮膚を固定します。次に、腹膜を胸部まで破裂させます。胸腔に亀裂を入れ、横隔膜を切断することにより、心臓を露出させます。
4. 血液が動物から流れ出るように右心房をカットします。25ゲージの針が付いた10mLの注射器を左心室に挿入し、10mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で灌流します。
   手記： これにより、溶液は全身循環を通って流れ、右心房から出ることができます。
5. 10mLシリンジを取り外し、60mLシリンジに取り付けられた25ゲージの針を挿入します。氷冷した50mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で左心室から灌流します。.
   1. 10% PFA 溶液を H₂O で希釈し、最終的な 4% PFA 溶液を 4 °C で冷却して、氷冷した 4% PFA 溶液を調製します。
6. マウスの頭を分離し、頭蓋骨から脳を取り出します。
   1. 首から皮膚を切り取り、次に目に向かって切り取って頭蓋骨を露出させます。頭蓋骨を首から鼻まで、そして次に片方の眼球からもう片方の眼球まで割れます。頭蓋骨をはがし、脳全体を切除します。
7. 脳を4%PFAで4°Cで24時間インキュベー
トします。
8. 鉗子で脳を25mLの30%ショ糖溶液で満たされた50mLの円錐管に移します。脳がチューブの底に沈むまで、4°Cで48〜72時間保ちます。
9. 成体マウスの脳スライサーマトリックスで中脳(ブレグマの~3mm後部)を冠状に切断します。脳幹を含む脳部分を保持します.
   手記： これにより、脳のセクションは2つになります-1つは皮質の大部分(カットの前部)を含み、もう1つは脳幹/小脳(カットの後部)を含みます。次の手順では、脳幹セクションを使用します。
10. 最適な切断温度コンパウンド(OCT)で囲まれた埋め込み型の底に切断面を配置して脳幹部分を埋め込みます。埋め込まれた脳を-80°Cの冷凍庫に移し、さらに使用するまで少なくとも12時間凍結します。
11. クライオスタットでの切断:OCT中の脳を含む埋め込み型をクライオスタットに入れ、クライオスタットで数時間インキュベートして、脳ブロックの温度をクライオスタットの温度に調整します。
12. 埋め込み型をはがして、脳が入ったOCTブロックを露出させます。
13. カミソリの刃を使用して、脳に触れることなくブロックの表面から余分なOCTを取り除きます。
14. OCTブロックをクライオスタットのチャックに取り付け、脳の切断面を正面に向けて露出させます。
15. 脳の切断面を調整して、クライオスタットのカミソリの刃と平行に向きます。
16. 髄質から脳をトリミングし、吻側に100μmの切片を切断します。
17. 小脳と脳幹が1つの連続したスライスとして切断されるまで、吻側にトリミングします。厚さ50μmでスライスの収集を開始します.
    手記：髄質から吻側にトリミングすると、脳幹と小脳は2つの別々のセクションとして切断されます。吻側切片では、脳幹と小脳は最終的に第4脳室のレベルで融合します。第4脳室の横方向の縁が整形成されると、小脳と脳幹は1つの連続したスライスとして出てきます。
    1. OCTで囲んだ脳スライスを鉗子で収集し、PBSで満たされた24ウェルプレートのウェルに入れます(図1a)。青斑(LC)は、小脳と下丘がブレグマの後方~-5.52 mmで互いに出会うときに最も顕著になります(図2b)
       手記：LCの最も前方の部分は、小脳が完全に切片化され、ブレグマの~-5.34 mm後方で下丘を取り囲む必要がなくなると消えます(図2c)。

2. ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ(DBH)またはチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の免疫組織化学(図1)

1. 1日目
   1. 選択したスライスをPBSで5分間3回洗います。
   2. 0.5%リン酸緩衝生理食塩水と界面活性剤(PBSD)を4°Cで24時間透過処理します。
      1. 125 μLの洗剤を25 mLのPBSで希釈します。
2. 2日目
   1. スライスを0.5%PBSDで5分間3回洗浄します。
   2. 一次抗体である抗DBHまたは抗THを、0.5% PBSDで1:500の希釈度、4°Cで18時間添加します。
3. 3日目
   1. スライスを0.5%PBSDで10分間3回洗浄します。
   2. 目的の二次抗体(488 donkey anti-rabbit for green fluorescence)を0.5% PBSDで1:1000の希釈で16時間加えます。
   3. 24ウェルプレートをアルミニウムで包み、4°Cに置きます。
   4. スライスを0.5%PBSDで5分間3回洗浄します。
   5. PBSで5分間洗浄します。
   6. 鉛筆ブラシでスライスを水容器に移します。
   7. 水に浮かぶスライスを帯電したスライドに取り付けます。
   8. ハードセット封入剤ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼで覆い切片
   9. 取り付けた脳切片を室温で30分間乾燥させます。
   10. 共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡で、適切な二次抗体蛍光色素の波長からのシグナルを検出するための設定で脳スライスを画像化します。
   11. 顕微鏡を脳スライスの焦点面に合わせ、10倍の倍率で1枚の画像を撮影します。

結果

図1:DBHまたはTHの脳切片を免疫染色することによるLCの検出。(a)1匹のマウス脳を脳幹の周囲に50μmのスライスに切片化し、2つの24ウェル皿に集めた。収集された脳スライスの5番目から8番目は、XFMを介してイメージングするために、フィルムで覆われたカバースリップに取り付けられました。これらのスライスには、ウェル間に青い数字のラベルが付けられています。PBSに浮遊する隣接するスライスを免疫染色してDBHを検出し、LCを検出しました(ウェルに赤い十字で標識)。緑の円はDBH信号の正のスライスを示し、したがってLCが含まれています。(b)LCを含む冠状脳切片をDBHで免疫染色し、共焦点顕微鏡で画像化しました。この画像は、LCの強い信号を示しています(緑)。(c)LCを含む冠状スライスをチロシンヒドロキシラーゼ(TH)について免疫染色し、蛍光顕微鏡でイメージングしました。画像は、左右のLCの両方...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
成体マウス脳スライサーマトリックス	ジビック・インストゥルメンツ	BSMAS001-1
抗ウサギ二次抗体、Alexa Fluor 488 (出典 - ロバ)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-21206
チャージドスライドガラス	ジェネシー	29-107
共焦点顕微鏡	ツァイス	LSM 800
クライオスタット	マイクロム社	HM 505E
クライオスタットカッティングブレード	サーモフィッシャーサイエンティフィック	MX35
ハサミミニ、9.5cm	アンテック診断用ソフトウェア	503241
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)	シグマ・アルドリッチ	D9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) 抗体 - 自社生産 (出典 - ウサギ)	B.アイッパー	-
Dopamine β-hydroxylase (DBH) 抗体 - 市販 (出典 - ウサギ)	細胞シグナル伝達	8586
ファルコンチューブ、50ml	USAサイエンティフィック	339652
フォラン(イソフルオラン)	バクスター	NDC 1019-360-60
鉗子マイクロアドソン	アンテック ダイアグノスティックス	501245
ハードセットマウントメディア	EMサイエンス	17984-24
マイクロスコープ	パスカル	LSM 5
マルチウェルプレート、24ウェル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	930186
最適切削温度コンパウンド(OCT)	VWR/ティッシュテック	102094-106
パラホルムアルデヒド (PFA)/ホルマリン 10%	フィッシャーサイエンティフィック	SF98-4
Peel-A-Way 使い捨て埋め込み型	ポリサイエンシズ株式会社	18646A
鉛筆ブラシ
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ライフテック	14190250
カミソリの刃	アマゾン	ASIN: B000CMFJZ2
へら	アンテック診断	14374
Tピン	オフィスデポ	344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition	アマゾン	ISBNコード: 978-0123694607
Triton-X 100 (PBSD用)	シグマ・アルドリッチ	T8787
トゥイーン 20	シグマ・アルドリッチ	7949-500ml
チロシンヒドロキシラーゼ (TH) 抗体 (出典 - ウサギ)	EMDミリポア	AB152
広視野蛍光顕微鏡	ツァイス	アクシオ ズーム.V16