ショウジョウバエにおける閉鎖性頭部外傷性脳損傷の付与方法

要約

出典:Katzenberger, R. J., et al., A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila.J. Vis. Exp. (2015).

このビデオでは、ショウジョウバエに閉鎖性外傷性脳損傷(TBI)を誘発するためのHigh-Impact Trauma(HIT)デバイスの使用を示しています。TBIは、ニューロン機能に影響を与える機械的な脳外傷を引き起こし、時間の経過とともに神経変性と死亡率につながります。

プロトコル

1. HITデバイスの構成

1. 2つのclを使用してスプリングをボードに取り付けますamp と4本のネジ(図1A)。クランプをボードの幅に対して中央に配置し、外側のクランプをボードの端と同じ高さにして互いに突き合わせます。clを取り付ける前にamps、ペンチを使用してそれらを曲げてスプリングにしっかりとフィットさせます.
   手記： HITデバイスの構成に必要な材料の説明については、表1を参照してください。スプリングのクランプ端は、ボードの端から1/8インチ(3.2 mm)離れている必要があり、自由端はボード上に3/4インチ(19 mm)伸びている必要があります。スプリングがボードの長さと平行になるように調整します。
2. スプリングの自由端をベルクロループの粘着ストリップで一度包みます。ベルクロの外縁は、スプリングの端と同じ高さである必要があります。ベルクロは、タイトな圧縮フィッティングを作成することにより、バイアルをスプリングに固定するために使用されるため、重要です。また、ベルクロにより、バイアルの接続と取り外しが容易になり、多くのバイアルを短時間で処理することができます。
3. アイスバケツカバーを逆さまに、中央に置き、木の板にしっかりと密着させます。アイスバケツカバーの隆起した領域を、長い辺がボードの幅と平行になるように向きを変えます。アイスバケツの隆起した領域は木の板よりも1/2インチ(13 mm)高いため、バイアルがスプリングに取り付けられると、スプリングがボード上に平らにならないことに注意してください。
4. デバイス全体を壁などの固定物にスライドさせて、アイスバケツカバーがボードとオブジェクトの間に挟まれて動かないようにします。
5. 紙分度器を段ボールのフライバイアルトレイの底にテープで固定し、ボードの長さに対して端に立てて、90°マークが完全に垂直な位置に戻されたときにスプリングと揃
うようにします。

2. HITデバイスの操作

1. 空のバイアルに1〜60 CO₂麻酔フライを置き、ぴったりとフィットするコットンボールを使用してバイアルをストッパーします。
2. 綿球をバイアルの底から1インチ(2.5 cm)になるまで押し込み、ハエをバイアルの底1インチ(2.5 cm)に閉じ込めます。バイアルの1インチ(2.5 cm)マークに線を引くと便利です。ハエをバイアルの大きい領域または小さい領域に閉じ込めると、表現型の重症度に影響を与える可能性があることに注意してください。
3. フライが_CO2から機動性を回復するまで5分待ちます。_CO2の影響を完全に取り除くのに5分で十分かどうかは不明であることに注意してください。
4. ベルクロの内側の端がバイアルの上部と同じ高さになるまで、スプリングの端をバイアルに挿入します(図1B)。スプリングが平らになっているとき、バイアルの1インチ(2.5 cm)がアイスバケツカバーの隆起した領域と重なる必要があります。バイアルは何度も再利用できます。
5. 座ったまま、左手の親指と人差し指を使用してバイアルをベルクロ領域に保持します。右手でボードをベンチトップにしっかりと固定します。または、Cクランプを使用して、ボードをベンチトップにしっかりと固定します。
6. スプリングを希望の角度まで完全にまっすぐに引き戻します。スプリングを放します。スプリングが完全に停止するのを待ちます。
7. バイアルをスプリングから取り外し、ハエが≥5分間回復するのを待ちます。ハエを別のストライクにさらすか、ハエをハエの餌が入ったバイアルに移します。
   手記：HITデバイスからのストライクの表現型効果を評価するために、さまざまなアッセイを使用することができます。例えば、ハエが怪我をした後も生存する割合を解析することで寿命への影響を、頭部の組織学的解析により脳の形態への影響を、mRNAレベルの定量解析により遺伝子発現への影響を判断できます。
8. ストライクを受けていないコントロールフライを同じように扱うことにより、ストライクによるものではない手順の影響を判断します。バイアルがアイスバケツカバーに当たると大きな音がするので、聴覚保護具を着用してください。

結果

図1:HITデバイスの図。(A)静止位置のHITデバイスの上面図。(B)HITデバイスの側面図の図。スプリングは静止位置(濃い赤)で示され、90°(明るい赤)にたわみます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
亜鉛メッキコンプレッションスプリング	ザ・ヒルマン・グループ	540189	9 7/8 in (長さ), 15/16 in (外径), 0.12 in (ワイヤーサイズ)
木の板			9 インチ (長さ), 6.5 インチ (幅), 0.75 インチ (高さ)
クランプ	シグマ電機製造株式会社	49822	3.10 in (長さ), 0.68 in (幅), 1.11 in (高さ), EMT 2穴ストラップ, 1インチ鋼製EMTコンジットのタイプをクリック
粘着ベルクロのループ半分			3 in (長さ), (3/4 in width)
ポリウレタン製アイスバケツカバー	フィッシャーサイエンティフィック	02-591-45	9 1/8 in (長さ), 9 1/8 in (幅), 1 1/4 in (高さ)
プラスチック製のハエ瓶	アプライドサイエンティフィック	AS-510	3 11/16 in (高さ), 1 1/16 in (内径), 1 1/8 in (外径)
大きなコットンボール	フィッシャーサイエンティフィック	22-456-883
紙分度器			10 インチ (直径)