In vivo研究のための内側神経節隆起細胞のウイルス媒介標識と移植

要約

出典:Vogt, D. et al., Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence(MGE)細胞のIn Vivo研究用。J. Vis. Exp.(2015年)。

このビデオは、in vivo研究のための内側神経節隆起(MGE)細胞のウイルス標識と移植を示しています。ウイルスレポーターによるMGE細胞の形質導入、これらの形質導入細胞のマウス仔動物の皮質への移植、および特定の介在ニューロンサブタイプでのレポーター発現を可能にする手順を概説しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. レンチウイルスの調製(オプションのステップ)

1. 10 mL DMEM/10% FBSの存在下で作製する各レンチウイルスについて、HEK293T細胞の10 cmプレートを3枚分割し、~60-70%のコンフルエンスまで増殖させます。インキュベーター内で37°C、5%_CO2で細胞を増殖させます。
2. 任意のトランスフェクション試薬を使用して、次のDNAプラスミド(合計10 μg)を各プレートにトランスフェクションします:6.4 μg CAG-Flex-GFP レンチウイルスベクター、1.2 μg pMD2.G(VSV-gをコード)、1.2 μg pRSV-Rev、および1.2 μg pMDLg/pRRE。3種類のレンチウイルスパッケージングベクターは市販されています
   手記：このアプローチでは、第3世代レンチウイルスベクターを利用しますが、第2世代ベクターや関連するプラスミドも機能します。
3. BSL2認定フード内に10%漂白剤溶液を含む廃棄物容器を準備して、レンチウイルスに接触した、またはレンチウイルスを含む溶液またはデバイスを不活性化します。次に、漂白剤溶液へのトランスフェクションの4〜6時間後に培地を完全に除去し、同量の新しい培地と交換し、細胞を増殖させます。
4. 4日後、培地を50 mLのコニカルチューブに集め、1,000 x gで15分間遠心分離して、細胞破片をペレット化します。次に、0.45μmのメンブレンで上清をろ過します。PVDFのような低タンパク質結合フィルターは、どれでもうまく機能します。注意：固体と液体の両方のウイルス性廃棄物を漂白剤溶液に入れます。
5. ろ過した上清30 mLを超遠心チューブと超遠心分離機に入れます。100,000 x gで4°Cで2.5時間遠心分離し、BSL2フード内の遠心分離チューブを開き、上清を10%漂白剤に除去します。ペレットに~100 μlのPBSを添加すると、1x10⁷から1x10⁸感染性ユニット/mlの力価が得られます。翌日に分注し、-80°Cで保存します。
6. 重要な考慮事項:現在、多くの機関がウイルスコアを持っています。最適な結果を得るためには、最小力価1x10⁷感染性ユニット/mlの濃縮ウイルスを入手してください。

2. MGE解剖用ドナーマウス

1. まず、Cre発現する対象系統と野生型(WT)マウス、またはCre媒介組換え後にレポーターを発現するマウスとの間に時限交配を設定します。
   手記：多くのCre-driver系統はトランスジェニックであり、半接合状態で維持および繁殖されています。したがって、胚の半分だけがCre導入遺伝子を含むことになります。Cre対立遺伝子を検出するための短いPCRのために、胚からDNAを迅速に調製できます。その後、Cre⁺胚を採取して、目的の遺伝子型のMGE組織のみを使用するようにすることができます。あるいは、Cre依存性レポーターを使用して、MGE解剖および移植用の胚を選択することもできます。
2. E13.5に対応する日を計算します。動物が前日の夜にペアになっていた場合、プラグの日は0.5です。ドナー組織がE13.5になる日に出生後(P)1マウスを産むために、時限妊娠マウスまたはP1子犬を持つWTメスを注文してください。あるいは、ドナー動物をペアリングする1週間前に、これらの交配を家で設定します.
   手記：E13.5とP1の両方の胚/子を同じ日に生成するという前者の戦略は、多くの場合、確実に行うことが困難です。

3. メディア、ツール、機器の準備。

1. MGE細胞調製用の試薬とツールを調製します(表1)。
   1. きれいな表面を準備し、きれいな鉗子、はさみ、および顕微手術用ナイフまたは細い鉗子(正確な組織解剖用)のいずれかを表面に置きます。
   2. 解剖用のハンク平衡塩溶液(HBSS)と、形質導入用の10%ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベコ改変ワシ培地(DMEM)を調製します。
   3. 20-30 ml DMEM/10% FBSを37°Cの組織培養インキュベーターで約1時間プレインキュベートします。媒体のガス交換とpH平衡化を可能にするために、蓋を緩める必要があります.
      手記：培地のプレインキュベーションは、解剖を開始する直前に調製できます。

4. MGE細胞の調製

1. 承認された動物プロトコルに従って妊娠中のマウスを犠牲にし、氷冷HBSSを含む10cmのシャーレに胚を取り出します。
2. 解剖スコープを使用して各胚から脳を取り出し(一度に1つずつ行い、残りの胚は氷冷したHBSSに残します)、次にMGE組織の切り取りに進みます
   手記：以下と図1に詳述されているのは、MGEを取り外す方法を示す主要な手順です。
   1. 腹側を上にして脳を配置します(図1A、A ')。注:背側を上に向けても大丈夫です。矢状面に沿って脳を半分に切り、2つのピースを生成します。半角切除された脳の例が示されています(図1B、B')。脳の背側(上にある皮質)と腹側の側面が神経節隆起(GE)組織を覆い、囲んでいることに注意してください。
   2. 次に、利き手で、非常に細い鉗子または刺しナイフ(表1)を持ち、利き手ではない手で持った鉗子で半球を固定します。(半球の内側の側面が上を向いている必要があります)。鉗子とスタブナイフで背側組織と腹側組織を展開して、下にあるGE組織を明らかにします(図1Cおよび図1C'に図示).
      手記：解剖用ペトリ皿から一部の培地を取り除くと、MGE解剖を行う際に組織を安定させやすくなります。
   3. スタブナイフまたは細い鉗子でまっすぐに切り込みを入れ、CGE、LGE、および中隔組織を分離します(赤い破線で示された切り傷の例、図1DおよびD'を参照)。これらのカットは任意の順序で行うことができます.
      手記：MGEを周囲の組織から切り取られた「箱」として想像してください。そうすることで、各解剖で同様のカットを再現性よく行うことができ、組織解剖のばらつきを減らすことができます。
   4. 最後に、MGEを横向きにして、底(脳の外側の側面)を切り取ります。これにより、MGE のマントル ゾーン (図 1E と 1E' の破棄) が MGE の残りの部分から削除されます。MGEの残りの側面には、主にMGEの心室ゾーンと心室下ゾーンの部分が含まれ、これらにはほぼすべてのMGE前駆細胞が含まれています。このティッシュで進めます。
3. 重要な考慮事項:シャーレの底にシリコーンゲルを追加すると、鉗子の繊細な先端を保護し、鉗子で組織を固定するための柔らかい表面を提供するため、優れた解剖面として機能します。

5. レンチウイルスの標識と移植

1. MGE組織のチューブをBSL2認定フードに移動し、メディアを取り外します.
   手記：MGE組織は目に見えるほど大きく、チューブの底に沈殿するため、冷たい媒体を簡単かつ穏やかに除去できます。
2. 37°Cの組織培養インキュベーターでプレインキュベートしたDMEM/10% FBS培地を~500 μl加えます。次に、ポリブレンを添加して、最終濃度8 μg/mLで各チューブへの形質導入を促進します。MGE組織を粉砕し、P1000ピペットチップを使用して単一細胞懸濁液を作製します。最後に、各チューブに~15-20 μlの濃縮レンチウイルスを加えます。
3. 重要な考慮事項:10〜12回のトリチュレーションは、単一の胚からMGE組織を分割するのに十分ですが、複数のMGEが一緒にプールされている場合は、より多くのトリチュレーションが必要になる場合があります。さまざまなトリチュレーション条件を試して、何が最も効果的かを判断してください。
4. 各チューブをしっかりと閉じ、反転させて混合し、すべてのチューブを37°Cのインキュベーターに入れます。細胞をレンチウイルスで少なくとも30分、最大1時間インキュベートすると、時間が長くなると細胞生存率が低下します。時間切れになるまで10分ごとにチューブを反転させます。
5. レンチウイルスとインキュベートした後、インキュベーターからチューブを取り出し、~700 x gで3分間遠心分離して細胞をペレット化します。BSL2フードで、上澄みを取り除き、10%漂白剤に捨てます。次に、DMEM/10% FBSを1 mL添加し、ペレットを2〜3回粉砕して洗浄し、再度同じ速度で遠心分離して細胞をペレット化します。この洗浄手順をさらに2〜3回繰り返して、余分なウイルスを取り除きます
   手記：4°Cで遠心分離ステップを実行します。しかし、RTで短いスピンを行った場合、生存率の低下は観察されていません。
6. 最終洗浄後、できるだけ多くの媒体を取り除き、各チューブを氷の上に置きます。チューブの側面に培地が残っているため、移植手順が始まるまでに、~2〜3μlの培地が細胞ペレットを覆うことになります。

6. 移植と検証

1. 宿主P1の子犬を採取し、70%エタノールを噴霧して処置部位を準備します。処置中に無菌性を維持するために、専用の清潔な処置室でこれらの処置を行うことをお勧めします。さらに、オートクレーブ滅菌された手術器具を使用し、70%エタノールを使用して子犬が接触する表面を滅菌します。移植を行うために必要な代表的な機器の例と代表的な手順領域を図2に示します。
   注:この手順は少量の注射であり、切開、開放創、または縫合を必要とする外科的処置ではありませんが、注射するマウスごとに新しいマイクロピペットを使用することをお勧めします。マイクロピペットは、70%エタノールを噴霧した表面に引っ張って面取りし、密閉容器に保管すると熱滅菌されます。
   1. 先端の直径が40〜80μmのマイクロピペットを作成します。これらのディメンションに従うと、最適な結果が得られます。マイクロピペットを引っ張って表面に面取りしたときに加熱滅菌し、70%エタノールを噴霧してから、マイクロピペットを密閉容器に保管します><。 注:または、これらの針を作成するために必要なデバイス(表1)へのアクセスが制限されている場合は、他の注射デバイスを使用してください。.ただし、これらは直径が異なるため、マイクロピペットほど適していない場合があります。
   2. 鉱油を1mlの注射器に引き込み、30 1/2 Gの針でガラスピペットに鉱油を完全に満たします。次に、プランジャーを脳定位固定装置に取り付け、ガラスピペットを脳定位固定装置に取り付けてプランジャーにセットします。油圧駆動を使用して、プランジャーをガラスピペットの約半分まで動かし、こぼれた鉱物油を清潔なペーパータオルで取り除きます。
      1. シリンジを使用する代わりに、ピペットの後端を鉱物油に浸し、毛細管現象によって充填します。ピペット内の気泡を防ぐために、ガラスピペットから完全に出るまでシリンジの陽圧を維持します.
         手記：他のデバイスを使用して、MGE細胞を成功裏に移植することができます。この手順には、100 nl より小さいまたはそれに近いボリュームを提供できるデバイスであれば、どれでもうまく機能します。
   3. 次に、滅菌ペーパータオルまたは任意の吸収性材料を使用し、角を細かい点にねじって、MGE細胞ペレットの上の余分な媒体を繊細に除去します。このステップでは、細胞密度が濃縮されるため、注入量を小さくすることができます。次に、少量(P2が好ましい)ピペットを使用して細胞ペレットをゆっくりと引き出し、1〜2回回転させてから、細胞懸濁液を疎水性表面に移動します。容量は1μl未満である必要があります。針の先端を細胞懸濁液に移動し、油圧駆動を使用して細胞懸濁液をピペットに引き上げます。
   4. 低体温症でP1の子犬に麻酔をかけます(ラテックス手袋で包み、氷の上に2~4分間置きます)。有害な刺激による麻酔の有効性を確認してください。細かい鉗子でつま先の間の皮膚をつまむ:つまむと子犬は反応しなくなるはずです。次に、子犬を注入装置の下にある型に置き、頭の上の皮膚を引き戻し、標準のラボテープで固定して皮膚をぴんと張らせます><。 手記：低体温症は新生児マウスに非常に効果的で、死亡率は低くなりますが、子犬は10分以内に回復し始めるため、手順を迅速に行う必要があります。また、氷上での4分間は許容できる上限です。低体温症を誘発するのは、注射に時間がかかる場合は一度だけするようにしてください。ただし、子犬が早期に回復した場合は、まず子犬が完全に回復するのを待ってから、再び低体温症を誘発します。さらに、注射を行うには、もう一度低体温を誘発するだけで済みます。子犬は低体温から5〜10分以内に回復します。これは、子犬をトイレ砂と母親と一緒に置くか、子犬を暖かい表面に置いて回復させることで促進できます。
   5. 脳定位固定装置を使用して、ガラスピペットの先端を子犬の頭の表面に、頭の表面に対して垂直に配置します。ピペットがヘッドに接触している場合は、これを「0」と考えてください。次に、ピペットを皮膚と頭蓋骨の表面から皮質に押し込み、ピペットを~2回挿入および収縮させてから停止します。新皮質への細胞の最適な標的化のために、マイクロピペットが0.1mmの深さにあるときに注射が行われます。ただし、これはユーザーが最適化する必要があります（以下の注を参照）
      手記：この深さは、上記のデバイスを使用してより深い新皮質層を確実に標的にしますが、いくつかの深さを経験的にテストして決定する必要があります。さらに、さまざまな吻尾側および中外側の位置でさまざまな深さをテストして、各サイトで最適な深さを決定する必要があります。また、新皮質へのゆっくりとした浸透は組織にきれいに浸透する能力を低下させるため、最初の穿刺は迅速に行う必要があります。この手順を初めて開始するときは、さまざまな速度を試して、最適な速度を見つけてください。さらに、座標の試験では、色素が位置を示す信頼性が低かったため、標識細胞を使用することに代わるものはありません。
   6. 針が所定の位置にあると、油圧装置を回転させてプランジャーをガラスピペットに進め、一定量の細胞懸濁液を皮質に押し込みます。サイトごとに50〜70 nlsを注入します。目標が新皮質全体の細胞の広範な分布を取得することである場合は、異なる吻側尾側のレベルの3〜6の異なるサイトでこの手順を繰り返します.
      手記：100 nl以上の容量は病変を引き起こし、注入された細胞の大きな塊を引き起こし、注入部位から効率的に移動できなくなる可能性があります。したがって、注入量が少ない(~70 nl 以下)ことが最適であり、時間が許せば、より多くの部位で注入することができます。
   7. 注射が完了したら、子犬をステージから取り出してマークを付けます(つま先のクリッピングは、後で子犬を識別するための信頼できる方法です)。子犬が回復して自力で動くことができるようになったら(これはステージから取り除いてから数分以内に起こります)、母親と同腹児と一緒に戻します><。 手記：これは低侵襲の手順であるため、子犬が自由に動いて温まると、術後の手順はありません。ただし、子犬は手術後だけでなく、翌日もチェックして、健康状態が悪化する兆候がないことを確認する必要があります。
   8. 次の子犬の手順を開始する前に、70%エタノールをその領域にスプレーして、無菌の作業領域を維持します。注射された子犬が発達するのを待ってから、適切な発達段階で組織を評価します。

表 1. 試薬とツールのインベントリリスト。培地、解剖ツール、移植用代表的な機器、DNAベクターなど、市販の試薬の在庫です。(N.A.)利用できない、または適用されません。

型 の 名

MGE細胞の調製と形質導入のための試薬と機器			カタログ #	会社
1)	ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム、高グルコース		12491-015	ライフテクノロジー
2)	熱不活化ウシ胎児血清		〒10437-077	ライフテクノロジー
3)	ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、カルシウムやマグネシウムは含まれていません		14170-112	ライフテクノロジー
4)	1.5 ml微量遠心チューブ(または蓋付きの他の収集チューブ)		3810倍	エッペンドルフインターナショナル
5)	ポリブレン		SC-134220	サンタクルスバイオテクノロジー
6)	刺しナイフストレート22.5°(オプション)		リファレンス72-2201	外科専門法人
7)	ペトリ皿(10cm)、組織解剖用		FB0875713	フィッシャーサイエンティフィック
8)	2 デュモンのような細い先端鉗子 #5		11254から20	ファインサイエンティフィックツール
9)	37 °C 組織培養インキュベーター、5% CO2 インプット		C150	バインダー
10)	1.5mlの微量遠心チューブを回転させることができる卓上遠心分離機
11)	細胞トリチュレーションに使用できる任意のP1000ピペット
12)	バイオセーフティレベル2フード
in vitro MGE初代培養用試薬および装置			カタログ #	会社
1)	Lab-TekIIチャンバースライド、カバー付き、8ウェル		154941	サーモフィッシャー
2)	ポリ-L-リジン0.1%重量/体積		P8920	シグマ・アルドリッチ
3)	マウスラミニン、0.5-2 mg/ml		23017-015	ライフテクノロジー
4)	神経基底培地		21103-049	ライフテクノロジー
5)	B27無血清サプリメント		17504044	ライフテクノロジー
6)	Glutamax, 100x stock		35050-061	ライフテクノロジー
7)	ペニシリン-ストレプトマイシン、100倍ストック		15070-063	ライフテクノロジー
8)	Glucose, (水に25%溶液を調製)		G5400	シグマ・アルドリッチ
MGE細胞移植用試薬・装置			カタログ #	会社
1)	1mlシリンジ		参照309602	BD、ベクトン・ディッキンソンとその会社
2)	30 1/2 G 針		305106	BD、ベクトン・ディッキンソンとその会社
3)	5μlを供給する精密ボア(プランジャー付属)		5-000-1005	ドラモンド科学会社
4)	パラフィルム		PM-999	株式会社ポリサイエンス
5) **	ブームスタンド付き実体顕微鏡		MZ6	ライカ
6) **	マウス定位固定装置専用のデジタル		51725Dさん	ストールティング会社
7) **	単軸油圧ファインマイクロマニピュレーター		モ-10	成茂
8)	ダイヤモンドコーティングロータリーベベラー		N.A.	自社製
9)	ニードルピペットプーラー		730	Kopfの機器
10)	鉱油		N.A.	ドラッグストアや薬局
11)	1μlの容量を確実に測定できるピペットとチップ
	** これらは私たちが使用するモデルですが、他の多くのセットアップも動作するはずです
オプション試薬(レンチウイルス作製用)			カタログ #	会社
1)	25 mm、0.45 μm フィルター		09-719B	フィッシャーサイエンティフィック
2)	超透明遠心分離管(25 x 89 mm)		344058	ベックマン・コールター®
3)	リポフェクタミン 2000	(1.5mlサイズ)	11668019	インビトゲン
その他の市販の備品			カタログ #	会社
1)	pMDLg/pRRE プラスミド符号化 gag/pol		12251	アドジーン
2)	pRSV-Rev プラスミドエンコーディングRev		12253	アドジーン
3)	pMD2.GプラスミドエンコーディングVSVG		12259	アドジーン
4)	pAAV-Flex-GFP		28304	アドジーン

結果

図1.E13.5 MGE組織の解剖の代表的な手順。初代培養または移植のためのMGE組織の解剖例 (A-E) E13.5脳解剖の画像、および(A'-E') 手順の構造と重要なステップを強調するための概略図. (A, A') 腹側から見た代表的なE13.5脳。赤い線は、脳を2つの部分に半分割する最初のカットを示します。 (B、B')1つの脳半解剖の図。内側のアスペクトが見える、外側のアスペクトが下がっています。背側皮質(青色)からの組織は、神経節の隆起を覆っています。(C, C') 上にある組織を剥がした後の露出した神経節隆起の図と図。 (D, D') (C, C')

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MGE細胞移植用試薬・装置
1mlシリンジ	参照309602	BD、ベクトン・ディッキンソンとその会社
301/2ゲージ針	305106	BD、ベクトン・ディッキンソンとその会社
5μlの精密ボア(プランジャー付属)	5-000-1005	ドラモンド科学会社
パラフィルム	PM-999	株式会社ポリサイエンス
ブームスタンド付き実体顕微鏡**	MZ6	ライカ
マウス専用デジタル脳定位固定装置**	51725Dさん	ストールティング会社
1軸油圧ファインマイクロマニピュレーター**	モ-10	成茂
ダイヤモンドコーティングロータリーベベラー	N.A.	自社製
針ピペットプーラー	730	Kopfの機器
鉱油	N.A.	ドラッグストアや薬局
1 μlの容量を確実に測定できるピペットとチップ
**これらは私たちが使用する特定のモデルですが、他の多くのセットアップも機能するはずです
オプション試薬(レンチウイルス作製用)
25 mm、0.45 μmフィルター	09-719B	フィッシャーサイエンティフィック
超透明遠心分離管(25 x 89 mm)	344058	ベックマン・コールター®
リポフェクタミン2000(1.5mlサイズ)	11668019	インビトゲン
その他の市販用品
pMDLg/pRRE プラスミドのコード化 gag/pol	12251	アドジーン
pRSV-Rev プラスミドエンコーディング Rev	12253	アドジーン
pMD2.G プラスミド VSVG エンコード	12259	アドジーン
pAAV-フレックス-GFP	28304	アドジーン

の 名