細胞外タンパク質を単離するためのマウス脳からの間質液の微小透析

要約

出典:Yamada, K. In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluids with High-molecular Weight Cut-off Probes.J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、マイクロダイアリシスプローブを使用してマウスの脳の間質液(ISF)から細胞外タンパク質を収集するプロセスを示しています。高分子量のカットオフ半透膜を備えたマイクロダイアリシスプローブを、埋め込まれたガイドカニューレを介して麻酔をかけたマウスの脳に挿入します。ポンプに接続されたプローブは、生理学的緩衝液が脳組織を灌流し、ISFと混合することを可能にします。ISF中のタンパク質は半透膜を横切って拡散し、分析のために収集されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 術前処置

1. 手術を開始する前に、無菌状態を維持するために70%エタノールですべてを拭いてください。
2. クロラール水和物(400 mg / kg)の腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけます。つま先をつまむことで麻酔を確認します。導入時にはメロキシカム SR を使用し、回復時にはブプレノルフィンを使用します BID (bis in die、1 日 2 回) 少なくとも 24 時間使用することをお勧めします。
3. 外科用バリカンで髪を剃ります。マウスと新生児用ラットアダプターにマウスをイヤーバーとノーズクランプで固定します
   手記：この段階でマウスの頭が固定され、横に動かないようにすることが重要です。
4. 麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を塗ります。

2. ガイドカニューレ留置術のための脳定位固定術

1. マウスと新生児用ラットアダプターを定位固定装置にセットします。メスを使用して、頭蓋骨の上の皮膚を矢状に切開します。湿らせた綿棒を使用して、頭蓋骨の血液と結合組織を拭き取ります。
2. ブレインアトラスを使用して、関心のある脳領域の座標を決定します。測定を開始する前に、ドリルビットをAPで動かし、中線縫合糸にずっと留まることができるように、正中線がまっすぐであることを確認してください><。 手記：本稿では、後部海馬を対象とする座標(A/P:-3.1mm、M/L:-2.5mm、D/V:-1.2mm、12度)を用いています。
3. レベルスカルA-P
   1. 脳定位固定装置フレームのマニピュレーターにドリルを取り付けます。ドリルがラムダにそっと触れるまでドリルを下げ、腹側座標を記録します。この手順を bregma.
      に対して繰り返します 手記：頭蓋骨が水平になると、ブレグマの垂直方向の測定値はラムダの垂直方向の測定値と等しくなります。そうでない場合は、ノーズclの高さを調整しますamp それに応じて。頭蓋骨が水平になったら、ブレグマの前後、横方向の座標を記録します。
4. レベル、頭蓋骨、左右
   1. ドリルをブレグマから座標(前後[A / P]:-3.1 mm、中外側[M / L]:+ 2.0 mm)に移動し、ドリルを頭蓋骨まで下げて垂直座標を記録します。次に、座標(A / P:-3.1 mm、M / L:-2.0 mm)に対してこの手順を繰り返します。
      手記：頭蓋骨が水平になっている場合、正中線から等距離にある 2 つの点のこれらの垂直測定値は等しくなります。そうでない場合は、イヤーバーの高さを調整します。
5. ターゲット座標(A/P:-3.1mm、M/L:-2.5mm)に慎重にバリ穴を開け、ガイドカニューレを埋め込みます。バリ穴の直径がガイドカニューレの埋め込みに十分な大きさでない場合は、最初の穴と重なる別の穴を開けます。右側(反対側)の頭頂骨に別の穴を開け、骨ネジを挿入して、歯科用セメントを1.10で固定します(図1Bを参照)。
6. 1.5mLの遠心分離管の蓋の裏側から円形のロッキングピースをカミソリの刃で切り取り、「クラウン」を作ります。このクラウンは、歯科用セメントが皮膚に広がるのを防ぐために使用されます。ステップ2.5で作ったバリ穴が円内に留まるように、頭蓋骨の上に置きます(図1を参照)。
7. 脳定位固定装置アダプターの短い方のアームにガイドカニューレを装着し、袋ナットで固定して脳定位固定装置を組み立てます。脳定位固定装置アダプターの長い方のアームを電極クランプにセットします。脳定位固定装置のマニピュレーターに取り付けます(図1Aを参照)。
8. マニピュレーターアームの背腹側(DV)ステレオタックスアセンブリを12度回転させます(図1Bを参照)。ガイドカニューレを1.6で作ったバリ穴に移動します。ガイドカニューレを1.2mm下げてゆっくりと脳に挿入します><。 手記：プローブの角度は海馬に固有です。他の領域では、他の角度が必要な場合や、角度がまったく必要ない場合もあります。正確な座標については、脳地図帳を参照してください。そうしないとセメントが付着せず、セメントキャップが外れる可能性があるため、頭蓋骨の表面を乾燥
させます
9. クラウン内に歯科用セメントを追加して、ガイドカニューレの金属部分と骨ネジの両方をしっかりと覆い、それらを固定します。頭蓋骨の一部が露出している場合は、追加の歯科用セメントを塗布します。
10. 歯科用セメントが完全に乾くまで待ちます(~12-20分)。定位固定装置アダプターを電極クランプから取り外します。袋ナットを取り外し、脳定位固定アダプターをダミープローブと交換して、袋ナットを固定します。
11. マウスを定位固定装置から解放し、マウスを個々のケージに単独で収容します。
    手記：マウスは、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、放置しないでください。マイクロダイアリシスの日まで毎日マウスをチェックしてください。マウスは、痛みを感じているように見える場合、カルプロフェンなどの非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)を受け取ります。マウスが新しい環境に慣れるためには、睡眠覚醒研究に2週間待つ必要がありますが、他の種類の研究では、より短い回復期間(たとえば、1〜2日)が必要になる場合があります。

3. マイクロダイアリシスのセットアップ

1. プローブの品質チェック:使い捨ての1mlシリンジに蒸留水を入れ、バイトンチューブを使用してプローブの出口(短いポート)に接続します。通気孔を指で覆い、シリンジプランジャーを静かに押し下げてプローブに水を注入します。プローブ入口から水が出ていること、およびマイクロダイアリシスメンブレンの表面に漏れがないことを確認します。
   1. プローブの活性化:プローブの膜をエタノール(70〜100%)に2秒間沈めます。次に、蒸留水を再びシリンジでプローブに注入します。
2. 灌流緩衝液の調製:標的分子のチューブへの付着を避けるために、人工脳脊髄液(aCSF:1.3 mM CaCl₂、1.2 mM MgSO₄、3 mM KCl、0.4 mM KH₂PO₄、25 mM NaHCO₃、122 mM NaCl、pH = 7.35)で30%BSAを希釈してBSAを添加します。これはCSFの電解質濃度とほぼ一致します。 使用直前。0.1 μmの細孔サイズのシリンジフィルターユニットを介して灌流バッファーをろ過します。
   注:4%ウシ血清アルブミン(BSA)は、付着タンパク質の回収率を向上させますが、特にBSA結合性の高い化合物の場合、化合物の送達を厳しく制限する可能性があります。これは、特定の場合に低濃度のBSA(0.15%など)を使用する利点の1つです。BSAは、渦や攪拌板によって攪拌されると非常に簡単に凝集する可能性があることに注意してください。これらの凝集体は、プローブやメンブレンの細孔を詰まらせる可能性があります。BSA ソリューションを準備するときは、この集約を制限するように注意する必要があります
3. 入口と出口に2つの別々のラインを準備し(図1Cを参照)、両方のラインを接続針で接続します。灌流バッファーを充填した使い捨ての3 mLシリンジを充填し、鈍い端の針を使用してチューブの入口端に接続します。シリンジポンプを作動させて、チューブ全体に灌流バッファーを充填します。
4. シリンジポンプを停止し、入口ラインと出口ラインの間の接続針をステップ3.3の活性化されたマイクロダイアリシスプローブと交換します(図1Cを参照)。この交換の前に、プローブにキャップナットを取り付けます。
5. ローラーチューブをローラーポンプの出口チューブに取り付けます。シリンジポンプを10μL / minで開始し、次にローラーポンプをわずかに遅い流量(9.5〜9.8μL / min)で開始します。チューブ全体の気泡は、プローブに入るときの回復に影響を与える可能性があるため、必ずすべて取り除いてください。
6. ステップ1.12から、ステップ1.2と同じ方法でマウスに麻酔をかけます。マウスの首輪を首にかけます。袋ナットとダミープローブを取り外し、ガイドカニューレを通して3.4からのマイクロダイアリシスプローブをゆっくりと挿入し、袋ナットを固定します。
7. マウスを自由移動システムに接続されたケージに入れ、マウスを首輪でつなぎます。シリンジポンプとローラーポンプの両方を、ステップ3.5で示された流量で少なくとも1時間
   運転し続けます 手記：覚醒している動物からISF収集を達成するために、この記事では、ケージ自体が動物の動きに反応してチューブがねじれないようにする自由移動システムを使用しています。あるいは、さまざまな会社から入手可能な液体スイベルも使用できます。
8. 最初にローラーポンプを停止し、次にシリンジポンプを停止します。希望の流量を設定します。シリンジポンプはローラーポンプよりも20%速く動作します.
   手記：例えば、1μL/minで運転する場合は、シリンジポンプを1.2μL/minで運転します。最適な流速は、各分子について経験的に決定する必要があります。
9. ISFサンプルの収集:アウトレットチューブの自由端を冷蔵フラクションコレクターに置きます.
   手記：適切なサンプル量は、分析に使用するアッセイによって異なります。
10. 実験終了後、プローブを取り外してください(必要に応じてマウスに麻酔をかけてください)。マウスの回復は、手順2.11と同じ方法で処理します。収集したISFは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)や酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの方法で分析します。
11. マイクロダイアリシス後にチューブ全体を洗浄するには、プローブを接続針と交換してインレットチューブとアウトレットチューブを再度接続し、希釈した漂白剤をチューブ全体に流してから水で洗い流します。乾燥させて保管し、繰り返し使用してください.
    手記：他のタイプのチューブも許容されますが、灌流バッファー中のBSAは小径でチューブを詰まらせる可能性があるため、これらのチューブは使い捨てと見なされます。チューブは何度も使用すると摩耗したり詰まったりする可能性があるため、使用前に毎回流量が一定であることを確認してください。

結果

図1:手術のセットアップとマイクロダイアリシス回路の構築。(ア)キャップナット、脳定位固定装置アダプター、ガイドカニューレを使用して、ガイドインプラント用の定位固定装置アセンブリをセットアップします。(イ)ガイドカニューレを埋め込む脳定位固定術。ガイドカニューレは、垂直に対して12度で脳に挿入されます。(C) 入口チューブと出口チューブの構造。インレットラインは70cmFEPチューブ(JF-70)で構成され、アウトレットラインはJF-70とローラーチューブ、およびFEPチューブの1/2で構成されています。接続針は接続ごとに使用されます。(ダ)チューブ全体が灌流バッファーで満たされたら、ポンプを停止し、インレットラインとアウトレットラインの間の接続ニードルを活性化されたマイクロダイアリシスプローブ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ユニベントール820マイクロサンプラー	ユニヴェントール	8303002	冷蔵フラクションコレクター
シリンジポンプ	KDサイエンティフィック	KDS-101
ローラーポンプ	アイコムマイクロダイアリシス	ERP-10
ラターンスタンドアローンシステム	BASi	MD-1409	フリームーブシステム
デュアルスピーシーズケージキット	BASi	CX-1600
AtmosLM マイクロダイアリシスプローブ (軸長8 mm、メンブレン長2 mm)	アイコムマイクロダイアリシス	PEP-8-02	プローブ、ガイド、デュミープローブ、および脳定位固定装置アダプターのシャフトの長さは同じである必要があります。
マイクロダイアリシスガイド(軸長8mm)	アイコムマイクロダイアリシス	ペグ-8
マイクロダイアリシスダミープローブ(軸長8mm)	アイコムマイクロダイアリシス	PED-8
ボーンスクリュー	BASi	MD-1310
スーパーボンドC&Bセット	サンメディカル		歯科用セメント
デジタルディスプレイコンソール付き小動物固定装置	コップフ	モデル940	脳定位固定装置
マウス・新生児用ラットアダプター	ストールティング	51625
マウス定位固定装置用の標準イヤーバーとゴムチップ	ストールティング	51648
ウシ血清からのアルブミン溶液	シグマ	A7284-50ミリリットル	30% BSAソリューション
FEPチューブ(70cm)	アイコムマイクロダイアリシス	JF-10-70	内容積 = 0.5 μL/cm
テフロンチューブ(50cm)	アイコムマイクロダイアリシス	JT-10-50	内容積 = 0.08 μL/cm
バイトンチューブ	アイコムマイクロダイアリシス	JB-30
イントラメディック ルアー スタブ アダプター 23G	BD	427565	鈍い端の針
ローラーチューブ	アイコムマイクロダイアリシス	RT-5S	内容積 = 4 μL
キャップナット	アイコムマイクロダイアリシス	AC-5
0.25 mL 微量遠心チューブ キャップ付き	QSP	503-Q	フラクションコレクター用チューブ
ステロタキシックアダプター(軸長8mm)	アイコムマイクロダイアリシス	PESG-8
接続針	アイコムマイクロダイアリシス	RTJ
ネズミの動物の首輪	BASi	MD-1365
高速ロータリーマイクロモーターキット	フォアドム	K.1070	ドリル
ピクロトキシン	シグマ	P1675
骨ねじ用ドライバー
メス
綿棒
手術用バリカン