ミクログリア膠芽腫共培養を用いたマトリックスベース腫瘍浸潤モデル

要約

出典:Coniglio, S., et al. 膠芽腫浸潤のマクロファージおよびミクログリア刺激を研究するための共培養アッセイ。J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、膠芽腫とミクログリアの細胞をポリマーマトリックス溶液と混合し、ゲルが形成される多孔質チャンバーインサートに移して細胞を埋め込みます。ミクログリアは、多孔質インサートを介して膠芽腫細胞の移動を刺激し、腫瘍細胞の周囲の組織への浸潤を模倣し、細胞を固定してさらなる分析の準備をします。

プロトコル

1. 細胞の蛍光標識

注:膠芽腫細胞株とミクログリアを蛍光色素で標識します9。あるいは、GFP/RFPなどの蛍光タンパク質を構成的に発現する細胞株を作製します。

1. 6ウェルプレート上のプレートセルは、染色日に70〜80%がコンフルエントになるようにします。マウス膠芽腫細胞株GL261およびヒト膠芽腫細胞株U87の場合、染色の24時間前に、それぞれ1 x 10⁶および1.5 x 10⁶細胞を6 cm皿にプレート
化します。
2. DMSO(ジメチルスルホキシド)中の蛍光細胞染色色素溶液を調製し、ロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地(RPMI)またはマクロファージ無血清培地(MSFM)のいずれかの培地に5μM色素をボルテックスウェルで加えます。
3. 細胞を色素と37°Cおよび5%CO₂で30分間インキュベー
トします。
4. 色素を含む培地を取り出し、新しい培地(RPMIまたはMSFM)を細胞に加えます。
5. 細胞を30分間インキュベートします。注:これで細胞が染色され、実験で使用する準備が整いました。

2. Invasion Assay "3D"-Implantdging Glioma and Macrophage/Microglia in Matrix

1. マトリックス混合物を4°Cで一晩解凍します。フード内の氷上のマトリックスを使用して、それ以上のすべての操作を実行します。
2. 10 mg/mL 濃度のマトリックスを培地 (MSFM または RPMI) に 0.3% BSA で調製します。
   手記： マトリックスのストック濃度は通常、約15 mg / mlです。
3. マトリックス中の懸濁液用の細胞(ステップ1で標識)を調製するには、吸引によって細胞から培地を除去します。2 mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)/PBS(リン酸緩衝生理食塩水)で皿の上で細胞を洗浄します。2 mM EDTA/PBS500 μLを細胞に加え、37°Cおよび5% CO₂で5〜10分間インキュベー
トします。
4. 0.3% BSAを含有する5 mLの培地に細胞を再懸濁します。
5. 120 x gで5分間遠心分離します。
6. ペレットから上清を吸引します。ペレットを培地/0.3% BSAに再懸濁し、細胞の濃度が1 x 10⁶細胞/mlに等しくなるようにします。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
7. 1.5 × 10⁵ GL261 細胞 (150 μl) + 5 × 10⁴ microglia 細胞 (50 μl) を 1.5 mL のマイクロチューブに添加します。2 x 10⁵ GL261 細胞 (200 μl) を別の 1.5 ml マイクロチューブに加えます><。 手記：ミクログリアを含まないGL261細胞のみがコントロールとして機能します。
8. 細胞をマイクロフュージで120 x gで5分間スピンします。
9. 細胞を氷上の200 μlのコールドマトリックスに再懸濁します。
10. 50 μl (50,000 cells) を 8 μM のポアサイズチャンバーインサートの上部コンパートメントの中央にプレートします。
11. 重合が起こるまで、37°Cで30分間インキュベートします。
12. 200 μlの無血清培地を上部チャンバーに、700 μlの血清含有細胞増殖培地を下部ウェルに加えます。
13. 37°C、5%CO₂で48時間インキュベートします。
14. インキュベーション後、穏やかに吸引してチャンバーの上部から細胞を取り出し、PBS中の3.7%ホルムアルデヒドに細胞を入れてチャンバーを固定します。チャンバーを室温で15分間(または4°Cで一晩)固定液に保持します。緩やかな吸引で固定液を取り除き、1x PBS500μlと交換してください。画像解析のセクション 4 に進みます。

結果

図1:ミクログリア/マクロファージ刺激神経膠芽腫細胞浸潤を評価するための2つの異なるプロトコルの概略図。トップパネルは、プレコートされたマトリックスチャンバーインベージョンアッセイを示しています。下のパネルは、3Dマトリックスインベージョンアッセイを示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix	コーニング/フィッシャーサイエンティフィック	ネコ: 354481
マクロファージ無血清培地 (MSFM) (500 ml)	ライフテクノロジーズ	12065-074
CellTracker レッド CMTPX 染料	ライフテクノロジー/分子プローブ	C34552
CellTracker グリーン CMFDA 染料	ライフテクノロジー/分子プローブ	C2925
GL261細胞株	米国国立がん研究所(NCI)
THP-1細胞株	アメリカンティッシュタイプカルチャーコレクション	ATCC TIB-202
RPMI 1640 ミディアム (500 ml)	ライフテクノロジーズ/ギブコ	11875-093
ホルムアルデヒド溶液	シグマ・アルドリッチ	F1635
Corning Transwell ポリカーボネート膜細胞培養インサート (8 μM ポア) 48/パック。	コーニング	CLS3422
Cultrex 3-D 培養マトリックス 低成長因子基底膜抽出物 PathClear	トレビゲン	3445-005-01
子牛胎児血清(FBS)	ライフテクノロジーズ	ネコ: 10500064
ウシ血清アルブミン、フラクションV、ヒートショック治療	フィッシャーサイエンティフィック	BP1600-100
0.5M EDTA	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15575-020