胎児神経幹細胞のジカウイルス感染

要約

出典:McGrath, E. L., et al., ジカウイルス感染 of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、ヒト胎児の神経幹細胞にジカウイルスを感染させる手順を実演しています。感染した細胞は、さらなる研究に使用できます。

プロトコル

1. ジカウイルス感染

注:ZIKVは温度に非常に敏感であるため、ZIKVストックを-80°Cで保存し、凍結/解凍サイクルを回避することが不可欠です。氷の上でアリコートを動かし続けます。

1. 24ウェルプレートに播種するには、合計で300万〜400万個の細胞が必要であるため、継代時には、感染と播種に必要な数の細胞を継代時にフラスコに入れてください。
2. 染色のために細胞を24ウェルプレートに播種する場合は、プレートを準備します[カバースリップを含むウェルに0.01%ポリ-D-リジン(PDL)を滅菌水でコーティングし、37°Cで1時間インキュベートします。24ウェルプレートの場合、ウェルあたり250μLのPDLを使用してください]。
3. 継代後、1 mLの細胞懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに入れ、200 x gで室温で5分間遠心分離します。次に、吸引によって上清を取り除きます。
4. 細胞ペレットをZIKVストックに再懸濁して、1から10のいずれかの感染の多様性(MOI)を獲得します。ZIKV溶液の容量は0.5mLを超えてはなりません。模擬処理(コントロール細胞)では、ZIKVストックに使用したのと同じ量と種類の培地で細胞を再懸濁します。
5. 上記細胞/ZIKV混合物を37°Cで1時間インキュベートし、チューブを2〜3回反転させた後、混合物を室温で216 x gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得ます。ペレットをdPBSに再懸濁し、室温で216 x gで5分間再度遠心分離します。
6. 吸引により上清を除去し、細胞を適切な培地で再懸濁し、感染した細胞を実験に必要なフラスコまたはプレートにロードします。細胞を24ウェルプレートに播種する場合は、ペレットを12 mLの適切な培地に再懸濁し、各ウェルに500 μLの懸濁液を加えます
   手記：この時点で、細胞を増殖培地に保持してZIKVが幹細胞に及ぼす影響を観察するか、ステップ6または7に進んでZIKVが分化プロセスに及ぼす影響を研究します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEMの	ギブコ	11965-092
F12	ギブコ	11765-054
グルコース (10%)	シグマ	G8644
HEPES (1M)	コーニング/セルグロ	25-060-c1
溶連菌ペン (100x)	ギブコ	15140-122
二酸化炭素インキュベーター	サーモフォーマ	モデル# 3110
遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75004221
生物学的安全キャビネット	Forma scientific Claas II A/B3	モデル# 1284
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩(PDL)	シグマ	P6407-5MG
ラミニン	インビトロジェン	23017-015