微小血管内皮細胞単層におけるリンパ球トランスマイグレーションの研究

要約

出典: Schulte-Mecklenbeck, A., et al., Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、血液脳関門(BBB)内皮モデルを介したリンパ球の移動の実験的調査を示しています。in vitroではヒト脳微小血管内皮細胞(HBMEC)の単層を作製し、リンパ球を含む末梢血単核細胞(PBMC)を単層に添加します。次に、細胞をインキュベートしてリンパ球のトランスマイグレーションを可能にし、移動した細胞をフローサイトメトリーを使用して定量します。

プロトコル

1. 細胞培養インサートの準備

1. 細胞培養インサートのコーティング
   重要な注意:細胞培養インサートの膜に触れないでください。
   1. 各細胞培養インサート(図1A)と96ウェル平底プレート(光学制御ウェル)の1ウェルに100 μLのフィブロネクチン溶液を添加します。37°Cで少なくとも3時間インキュベートします。インキュベーション後、フィブロネクチン溶液を吸引します。
   2. 100 μL HBMEC懸濁液を細胞培養インサートと光学コントロールウェルに加えます。600 μLの内皮細胞培地-基底培地(ECM-b)培地を細胞培養インサートの下部コンパートメントに加えます。バリアインテグリティ(図1B)に達するまで、37°C/5%_CO2で3〜4日間インキュベートし、光学制御ウェル内のHBMECを顕微鏡で評価して細胞増殖を確認します
      手記：4日を超える細胞増殖は推奨されません。

2. マイグレーションアッセイ

1. 末梢血単核細胞(PBMC)の調製。
   1. 10 mLのロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)培地を15 mLの遠心チューブに加え、200 μLのB27サプリメントを加えます。PBMCをカウントし、細胞を300 x gで5分間遠心分離します。PBMCを最終濃度5 x 10⁶細胞/mL RPMI/B27まで再懸濁します。
2. 移行アッセイのセットアップ
   1. 下部コンパートメントから培地を吸引し、続いてコンフルエントHBMEC単分子膜を含む細胞培養インサートの上部コンパートメントから吸引します(図1A)。ドナーごとに、細胞培養インサートにそれぞれ100 μL PBMC懸濁液を添加し、さらに1つの24ウェルプレートの1ウェルに添加します(in vitroコントロール)。
   2. 600 μL RPMI/B27を細胞培養インサートの下部コンパートメントに、500 μLをin vitroコントロールのPBMCに添加し、37 °C / 5% CO₂で6時間インキュベートします。
3. 移行したPBMCの収穫
   1. 鉗子を使用して細胞培養インサートを取り出し、メンブレンに触れずに400μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で底を慎重にすすいでください。細胞培養インサートを廃棄します。
   2. 20 μLのフローカウント蛍光球(約1,000ビーズ/μL)を細胞培養インサートの下部コンパートメントとin vitroコントロールに加え、よく混合します。得られたPBMC懸濁液1 mLをフローサイトメトリーチューブに移します。

3. フローサイトメトリー

1. サンプル調製
   1. PBMCを300 x gで5分間室温で遠心分離します。
   2. サンプルあたり100 μLのフローサイトメトリーバッファー(PBS/1%ウシ血清アルブミン[BSA]/2 mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA])に蛍光色素標識抗体を添加して抗体溶液を調製します。以下の結果では、1 μL の CD4-FITC (クラスター分化 4-フルオレセイン イソチオシアネート)、1 μL の CD3-PerCP/Cy5.5 (ペリジニンクロロフィルタンパク質/シアニン 5. 5)、1 μL の CD56-PC7 (フィコエリトリンシアニン 7)、1 μL の CD8-A700 (Alexa fluor 700)、および 1 μL の CD16-A750 (Alexa fluor 750) を使用しました。
   3. PBMCを抗体溶液100 μLに再懸濁し、4°Cで30分間インキュベー
   トします。
   4. 250 μLのフローサイトメトリーバッファーを添加し、300 x gで5分間遠心分離します。

結果

図1:炎症を起こしていないHBMEC単層と炎症を起こしたHBMEC単層におけるNK細胞サブセットの差分移動。トランズウェルインサートの写真(左)と実験装置の図(右)B. HBMECバリア機能の検証。左:HBMECで3日間培養したウサギ抗ヒトZonula occludens-1(ZO-1, abcam, 1:200)とヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG/シアニン3(IgG-Cy3, 1:300)を用いたタイトジャンクション分子ZO-1の免疫組織化学的染色。中央:培養2日目から4日目までのHBMECの経内皮電気抵抗(TEER)。右:500 U/mLインターフェロンガンマ(IFN-γ)および腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)による24時間刺激によるHBMECのエバンスブルー透過(「炎症を起こした」、「赤」)または刺激なし(「炎症を起こしていない」、「黒」)のエバンスブルー透...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PBSの	ギブコ	14190から094	CaCl2またはMgCl2なし
フィブロネクチン 1mg/mL	シグマ	F1141-5MG	ウシ血漿から
HBMECの	サイエンセル	1000
HBMECの	ペロバイオテック	PB-H-6023
ECM-bの	サイエンセル	1001-b
FBSの	サイエンセル	1001-b
ペニシリン/ストレプトマイシン	サイエンセル	1001-b
内皮細胞増殖サプリメント	サイエンセル	1001-b
トランズウェル	コーニング	3472	クリア、直径6.5mm、孔径3.0μm
96ウェルフラットボトムプレート	コーニング	3596
B27	ギブコ	17504-044	50倍濃縮
48ウェルプレート	コーニング	3526
RPMIの1640	ギブコ	〒61870-010
フローカウントフルオロスフィア	ベックマン・コールター	7547053
Na-EDTA(ナエドタ)	シグマ	E5134
BSAの	シグマ	A2153の
CD3-PerCP/Cy5.5	バイオレジェンド	300430	クローン UCHT1
CD56-PC7	ベックマン・コールター	A21692 (英語)	クローンN901
CD16 - A750	ベックマン・コールター	A66330 (英語)	クローン3G8
CD4-FITC	バイオレジェンド	300506	クローンRPA-T4
CD8-A700	ベックマン・コールター	A66332 (英語)	クローンB9.11