中大脳動脈閉塞後のラット脳の梗塞帯と脳浮腫の測定

要約

出典:Frank, D., et al. げっ歯類の脳サンプルの単一セットにおける脳卒中後の脳浮腫、梗塞ゾーン、血液脳関門の破壊の測定。J. Vis. Exp. (2020年).

このビデオは、中大脳動脈閉塞を受けたラットの脳切片における梗塞帯と脳浮腫の評価を示しています。梗塞領域は酸化還元染色を使用して特定されますが、画像解析ソフトウェアのブルーフィルターと閾値機能により、影響を受けた半球の梗塞領域と浮腫が定量化されます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 梗塞帯の決定

1. 中大脳動脈閉塞術(MCAO)の24時間後の梗塞帯(IZ)を測定します.
   手記： 体重が20%以上減少したラット、または発作や片麻痺を発症したラットは実験から除外されます。
2. 吸気ガス混合物を20%の酸素と80%の二酸化炭素に置き換えて、ラットが自発的に呼吸しなくなるまで、ラットを安楽死させます。
3. はさみと外科用鉗子を使用して、胸郭の下の腹壁から5〜6cmの横方向の切開で胸を開きます。
4. はさみと外科用鉗子を使用して、胸郭の全長に沿って横隔膜切開を行います。
5. 肺を慎重に変位させ、胸郭を左右の鎖骨まで切り込みます。
6. 心臓の左心室から200mLの生理食塩水で灌流します。.
7. 心臓の右心房をハサミで穿刺または切開します。
8. ギロチンを使って斬首を行い、脳組織を採取します。
9. 虹彩ハサミを使用して、大孔から頭蓋骨後面の遠位端まで両側で切断します。
10. 嗅球、頭蓋骨の腹側表面と背側表面に沿った神経接続を脳から分離します。
11. 頭から脳を取り除きます。
12. .009インチのステンレス鋼、コーティングされていない、片刃のカミソリの刃で厚さ2mmの水平セクションを作成することにより、6つの脳スライスを作成します。
13. 0.05% TTC中で37°Cで30分間インキュベートします。
14. 脳組織を顕微鏡スライドに置き、これらの6つの脳スライスを1600x1600dpiの解像度で光学スキャンします(例:図1を参照)。
15. フォトエディター(Adobe Photoshop CS2など)でチャンネルミキサー機能(Image > Adjustments > Channel Mixer)を使用してブルーフィルターを追加し、JPEGファイル形式で画像を保存します
    >手記：ブルーフィルターを適用すると、画像はグレースケールで表示されます。
16. ImageJ 1.37v.
    で保存した画像を開きます 手記： このコンピュータプログラムは、しきい値機能を使用して、黒または白のピクセルを分離して計算します(図2を参照)。
17. 画像の6つの脳スライスのそれぞれについて、メインメニューの「ポリゴン選択」ツールを使用して、各半球(右の負傷した同側と左の無傷の反対側)を別々の画像ファイルとして選択して保存します。
18. ImageJソフトウェアのメインメニューから「Image (イメージ)」>「Adjust > Threshold」を選択し、1つのブレインセットの各半球のピクセル数を測定することで、IZを決定するためのカットオフを設定します。
    >手記：このステップでは、ImageJソフトウェアでマクロを使用できます(コードについては補足ドキュメント1を参照してください)。カットオフは、グレーの色合いに応じて、どのピクセルを白に変換し、どのピクセルを黒に変換するかを決定するための重要なパラメーターです(例として図3と図4を参照)。次に、ImageJ は白と黒のピクセルを比較して IZ を決定します。染色プロトコルとスキャナーの設定に基づいて、0.220の一定のカットオフ値を使用しました。
19. Ratios of Ipsilateral and Contralateral Cerebral Hemispheres (RICH) 法を使用して、組織の腫れを補正するIZの測定を行います(図5の例を参照)
    
    手記：梗塞のサイズは、対側半球のパーセンテージとして評価されます。

2. 脳浮腫の判定

注:脳浮腫(BE)の測定にはImageJ 1.37vを使用してください。

1. MCAOの24時間後にBEを測定します。BEの計算には、左右の半球体積のデータ(単位)を使用します。
2. 1600x1600 dpi の解像度で光学スキャンを実行します (例: 図 1 を参照)。
3. 脳半球を選択し、ImageJ 1.37vでBEを決定するためのカットオフを設定します(上記のセクション1.17-1.19で説明
)。
4. BE面積は、次の式を使用してRICH法で計算された、影響を受けていない反対側半球の標準面積のパーセンテージとして表します(図5の例を参照)。
   
   手記：BE の程度は、対側半球のパーセンテージとして評価されます。

結果

図1:脳スライスのスキャン例。

図2:偽手術ラットとMCAOラットの代表的な脳スライス。

(A-B)スキャンした元の画像。(C-D)グレースケールへの変換。(E-G)しきい値機能。(G-H)ブルーフィルターの適用。(I-J)ブルーフィルター適用後の閾値機能。(K-L)閾値機能を使用して脳浮腫を評価します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
脳および組織マトリックス	シグマ・アルドリッチ	15013
光学スキャナー	カノン	カノスキャン4200F	解像度:3200 x 6400 dpi
ペトリ皿	シグマ・アルドリッチ	P5606
メスの刃 #11	シグマ・アルドリッチ	S2771
ソフトウェア
Windows用のAdobe Photoshop CS2	アドービ
イメージJ 1.37v	NIHの		ソースコードは無料で入手できます。著者のウェイン・ラズバンド(wayne@codon.nih.gov)は、米国メリーランド州ベセスダにある国立精神衛生研究所の研究サービス部門にいます
Office 365 プロプラス	マイクロソフト	-	マイクロソフトオフィスエクセル
Windows 10	マイクロソフト
試薬
2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド	シグマ・アルドリッチ	298-96-4
エバンスブルー 2%	シグマ・アルドリッチ	314*13*6

型 の