In Vitro血液脳関門モデルにおける経内皮電気抵抗の評価

要約

出典:Kuzmanov, I., et al. An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction.J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、in vitroでマウス脳微小血管内皮細胞の経内皮電気抵抗(TEER)を評価する方法を示します。TEER値が高い場合は、内皮細胞の結合が無傷であることを示し、活性化T細胞を追加すると、接合部バリアの破壊を反映してTEER値が低下します。

プロトコル

1. 経内皮電気抵抗(TEER)測定の設定と実行

1. 経内皮電気抵抗(TEER)装置の24ウェルモジュールを層流フードの下に置きます。蓋を取り外し、鉗子を使用して初代マウス脳微小血管内皮細胞(MBMEC)のインサートを装置内に配置します。
2. 810 μlの新鮮な培地をモジュールウェルの下部コンパートメントにピペットで入れます:インサートとモジュールウェルの壁の間に慎重に追加します。
3. 蓋を閉め、器具をインキュベーターに入れます。機器をコンピューターに接続します。インストルメントコントローラーの電源を入れ、ソフトウェアを開きます。
4. ポップアップウィンドウで「新しい測定」を選択します。「show TEER」と「show Ccl」のチェックボックスをオンにします。最初の測定が完了したら、「結果」タブで「check all wells」を選択して、すべてのTEERおよび細胞層の静電容量(Ccl)値を確認します。
5. ファイルを保存します: File>名前を付けて保存>' ファイルの名前'。
   注: TEER と Ccl は自動化された方法で継続的に測定されるため、3 日から 5 日間にわたってそれらの値を監視します。細胞の生存率が最適でない限り、培地を変更する必要はありません。これは、TEERの増加の欠如によって視覚化されます。
6. MBMECをT細胞と共培養する時点は、Cclが安定で1 μF/cm²未満で、TEERが最大レベルに達したときに選択してください。
7. TEER と Ccl の絶対値を注意深く検査し、MBMEC が十分にコンフルエントな単層を生成していないウェルは、そのようなウェルのチェックを外して除外します。
8. 残りの井戸をグループ化する:井戸を右クリックし、「新しい平均井戸に井戸を追加」を選択します。ポップアップウィンドウで名前を付けます。グループ化するすべての個々の井戸についても同じことを行います。
9. すべての平均ウェルをチェックして、共培養前のすべてのウェルの初期条件が同じであることを確認します。TEER の絶対値や TEER の傾きが大きく異なる場合、または標準誤差が大きすぎる場合は、グループ化をやり直します。
   注: ウェルの最適なグループ化は、実験グループ内および実験グループ間のTEER値の変動を最小限に抑えます。
10. 「実験」タブで「一時停止」を押し、装置を切断してインキュベーターから取り出します。層流フードの下の蓋を取り外します。
11. 必要に応じて、特定のサイトカイン、抗体、またはその他の物質の有無にかかわらず、事前に活性化されたT細胞および/またはナイーブT細胞を調製します。例えば、精製したネイティブ/低エンドトキシン(NA/LE)ラット抗マウスインターフェロン-γ(IFN-γ)抗体(クローンXGM1.2)を、TEER装置のウェルあたり20 μg/mLで調製したT細胞と混合します。
    注:グランザイムB阻害剤などの物質を使用する場合、T細胞刺激の開始時にT細胞培養に添加されます：例えば例えば、グランザイムB阻害剤II(Calbiochem)は、ジメチルスルホキシド(DMSO)の最終濃度10μMで単離されたT細胞と混合されます。
12. インサート(上部ウェルコンパートメント)からメディアの一部を取り除きます。例:150 μlを慎重にピペットで取り出します(MBMEC単分子膜を乱す可能性があるため、すべての培地を取り除くことは避けてください)。
13. 2 x 10⁵細胞/インサートを含む培地150 μlを慎重にピペッティングして、T細胞をMBMECに添加します。
    注:事前に活性化されたT細胞を回収する場合は、トリパンブルーフリー細胞のみをブラストしてください。
14. 蓋を閉め、装置をインキュベーターに戻します。機器を再接続し、「測定を再開」を押します。24時間後、「experiment」タブの「stop」を押して、ファイルを保存(File>Save)します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
セルZスコープ	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	内容: 24ウェルセルモジュール、コントローラー、cellZscopeソフトウェアv2.2.2
トランズウェルメンブレンインサート - 細孔径 0.4 μm	コーニング	3470	はTEER測定用をメインリードアウトとして
トランズウェルメンブレンインサート - 細孔径 3 μm	コーニング	3472	は、T細胞移行アッセイ前の品質管理としてのTEER測定用
24ウェル細胞培養プレート	グライナー	650 180	平底;MBMECカルチャー向け
96ウェル細胞培養プレート	共演者	3526	丸底;免疫細胞培養用
ノイバウアー計数室	マリエンフェルド	MF-0640010
ヒト胎盤由来のIV型コラーゲン	シグマ	C5533	MBMECコーティング液用
ウシ血漿由来フィブロネクチン	シグマ	F1141-5MG	MBMECコーティング液用
DMEM (+GlutaMAX)	ギブコ	31966-021	MBMEC単離およびMBMEC培地
ペニシリン/ストレプトマイシン	シグマ	P4333	MBMEC単離およびMBMEC培地
ヘパリン	シグマ	H3393	MBMEC培地用
ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)	ペプロテック	100-18B	MBMEC培地用
IMDM + 1% L-グルタミン	ギブコ	21980-032	T細胞培養液用
組換えマウスIFN-γ	ペプロテック	315-05	T細胞移行アッセイ用
組換えマウスTNF-α	ペプロテック	315-01A	T細胞移行アッセイ用
NA/LE精製抗マウスIFN-γ抗体	BDバイオサイエンス	554408	クローン XMG1.2;推奨最終濃度: 20 μg/ml
グランザイムB阻害剤II	カルバイオケム	368055	推奨最終濃度: 10 μM
PE抗マウスCD4抗体	バイオレジェンド	116005	クローンRM4-4;T細胞移動の解析用
トリパンブルー溶液、0.4%	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15250061	セルカウント用

セルカウント用