マウス脳のMeyner基底核における神経線維の免疫組織化学的染色

要約

出典:Singh, P., et al.マウス脳のMeynertの基底核におけるコリン作動性線維の長さの立体推定。J. Vis. Exp.(2020)

このビデオは、マウス脳切片のMeynert領域の基底核におけるコリン作動性線維の免疫組織化学的染色を示しています。切片をブロックし、一次対コリンアセチルトランスフェラーゼで処理し、続いてビオチン化二次抗体で治療します。アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体が添加され、これが二次抗体に結合し、続いて発色基質が添加されます。その後、切片を脱水してマウントし、顕微鏡で視覚化します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 灌流と組織処理

1. ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)による腹腔内注射を使用してマウスに麻酔をかけます。.つま先をつまんで応答がないことを確認してから続行します。
2. 氷冷した 0.1M ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) と 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を 0.1M リン酸緩衝液 (PB) に ~50 mL で経心灌流します< br /> 注意:PFAは有毒です。PFAを取り扱う場合は、個人用保護具(PPE)を使用してください。
3. 脳を取り出し、4°Cで0.1 M PB中の4%PFAに24時間浸して、固定後とします。DPBS3xで洗浄します。
4. 0.1 DPBS中の15%スクロース溶液に一晩交換し、次に0.1 M DPBS中の30%スクロース溶液に4°Cでさらに48時間交換します。
5. ショ糖溶液から組織を取り出し、-20°Cの温度にプリセットされたクライオトームチャンバーで凍結します。凍結したサンプルは、切片化まで-80°Cの密閉チューブに保存できます。
6. 最適な切断温度の包埋培地(材料の表を参照)に組織を埋め込み、試料ディスクにマウントします。クライオトームを使用して冠状平面で連続30 μmの厚さの切片を切断し、その結果、凍結保護溶液(30%グリセロール、30%エチレングリコール、40%DPBS;図 1A–C)。-20°Cの冷凍庫で保存します.
   注:可能であれば、より厚いセクション(例:50μm)が望ましいです。切片が切断順序に保たれていること、およびすべての切片が完全に凍結保護剤で覆われていることを確認してください。96ウェルプレートは、24ウェルプレートの代わりに切片を収集するために使用できます。
7. ウェルをプレートシーラーで覆い、蒸発や乾燥を防ぎます。プレートは、さらに使用するまで-20°Cで保管してください。-20°Cで保存された切片は、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)免疫組織化学について数ヶ月間安定です。

2. IHCの体系的なセクション選択

注:許容可能な誤差係数(CE)を達成するために必要なセクションの総数を知るために、パイロットスタディを行う必要があります。CE 値は、サンプリング手順の誤差の合計量の式です。最小値は最小誤差を表し、ここで使用するソフトウェアでは 0.1 未満の CE 値が許容できると見なされます (資料の表を参照)。

1. 形態学的特徴をFranklinやPaxinosなどの標準的なマウス脳アトラスと比較することにより、各脳の最初と最後のセクションを特定します。MeynertまたはNBMの基底核は、ブレグマ-0.0mmで始まり、-1.6mmで終わります。したがって、約50のセクションにNBMが含まれています。セクションの総数は、立体学に必要なパラメータの1つです。8^番目のセクション(SSF = 1/8)ごとに選択すると、分析に合計6〜7のセクションが得られ、パイロット研究では体積推定と繊維長推定の両方で許容可能なCEが得られました。
2. 最初の 8 つのセクションのいずれかからランダムに開始し、次に 8^番目のセクションごとに、NBM を含む最後の後部セクションまで全身的にサンプリングします (図 1C)。

3. 免疫組織化学

1. 凍結保存された切片を凍結保護剤で室温に移し、次に6ウェルプレートで0.1Mリン酸緩衝液(PB)に移します。
2. PBで3回洗ってください。
3. 0.3%H₂O₂をメタノール中で15分間インキュベートします。
4. トリス緩衝生理食塩水(TBS)で3回洗浄します。
5. 0.25% Triton X-100 in TBSで30分間インキュベートします。
6. 0.1% Triton X-100 中の 10% 正常ウシ血清 (NBS) を TBS 中で 30 分間ブロックします。
7. 1:1,000 希釈のヤギ抗ヒト ChAT 一次抗体 (材料表を参照) を TBS 中で 0.1% Triton X-100 および 1% NBS と 4 °C で 48 時間インキュベー
トします。
8. TBSで室温で3回洗ってください。その後のインキュベーションと洗浄はすべて室温で行ってください。
9. ビオチン化ウシ抗ヤギ二次抗体(材料表を参照)と1時間インキュベートします。
10. TBSで3回洗ってください。
11. アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体とインキュベートします(材料表を参照)。
12. TBSで3回洗ってください。
13. メーカーの推奨に従って、強化されたDABペルオキシダーゼ基質溶液(材料の表を参照)を使用して開発します。
    注意:DABは発がん性が疑われる物質です。接触や吸入により毒性があります。DAB を使用する場合は、PPE を使用します。
14. 切片を蒸留水で数回洗浄し、トリスpH = 7.6に保ちます。
15. ゼラチン化したスライドにセクションを取り付けます。1つの組織のすべての切片を同じスライドに載せることができます。切片を風乾し、70%、90%、95%、100%のエタノールをそれぞれ5分間2回脱水し、10分間のキシレン洗浄を2回行って切片を清浄します。封入剤を使用して切片を覆います(材料の表を参照).
    注:脱水とクリアの処理時間は、セクションの厚さに影響します。したがって、すべてのセクションで同じ条件を使用する必要があります。現在の研究では、最終的な厚さの平均値は21.11±0.45μmでした。
16. ヒュームフード内のセクションを乾かしておきます。ドライセクションは立体学の準備ができています。

結果

図1:本研究で使用した組織処理とサンプリングの図。サンプル調製とサンプリング。(A)小脳と嗅球は、標本ディスクに装着する前に取り外します。一方の半球の浅い縦方向の切開(線でマークされている)は、セクション内の脳の側面を識別するのに役立ちます。(C)24ウェルプレート(「X」でマークされている)から8番目のセクションごとに系統的に選択されていることを示す24ウェルプレートの概略図。(D)体系的に選択された6つのセクションでNBMの境界を区切る冠状セクションの概略図。(E-G)ChATで免疫染色した冠切片の代表的な画像とNBMの位置(概要)。(H)NBMの境界を示す高倍率画像。LV = 側脳室;VL = 腹外側視床核;ic =内部カプセル;GP = 淡蒼球;CPu =尾状被殻(線条体);NBM = Meynert の基底核 (Franklin と Paxinos のマウスアトラスでは 'B' として...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ABCキット	ベクターラボラトリーズ	PK6100
抗ChAT抗体	ミリポア、マサチューセッツ州、アメリカ	AB144P
ウシ反ヤギ IgG-B	サンタクルス・バイオテクノロジー	SC-2347
ウシ血清、成虫	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B9433
クライオスタット	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
エチレングリコール	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	324558
グリセロール	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G2025
過酸化水素	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1009
Immpact-DABキット	ベクターラボラトリーズ	SK4105	強化型DABペルオキシダーゼ基質溶液
ケタミン	ウェストワード・ファーマシューティカルズ、ニュージャージー州、米国	0143-9509-01
マイクロスコープ	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA	AF6000	電動ステージ、IMI-techカラーデジタルカメラ搭載
最適切断温度(O.C.T.)埋込み材	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	62550-12
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P6148
パーマウント実装媒体	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
トリトンX-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
トリズマ基地	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	トリスベース
トリズマ塩酸塩	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T5941	トリス塩酸塩
キシラジン	バイエル、レバークーゼン、ドイツ	ロンプン
キシレン、組織学グレード	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056