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$$\longrightharp{xx}$$,
1. シナプトソームのドーパミンの取り込み
注:このプロトコルは、2つの脳の並列評価のためのものですが、4つの脳を並行してシナプトソームドーパミン(DA)取り込み実験を行うためにも成功裏に使用できます。
- 準備
- 表1あたり48本の1.5 mLマイクロ遠心チューブをラベル付けします(各脳に24本)。各脳に属するチューブには異なる色を使用して、サンプル間の混乱を防ぎます。
- ラベル51シンチレーションチューブ#1-51。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を氷の上に置きます。これは、脳を冷やすために使用されます。
- 遠心分離機の電源を入れて、4°Cに予冷します。
- シナプトソーム調製中の正確な組織重量を得るために、2本のマイクロ遠心チューブを事前に秤量します(セクション2.6)。
- 4 mM HEPESと0.32 Mスクロースを混合して均質化バッファーを調製します。pHを7.4に調整し、氷上に保ちます.
手記：ホモジナイズバッファーは、-20°Cのアリコートに保持し、実験当日に解凍することができます。
- 25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1 mM アスコルビン酸(0.194 g/L)、5 mM D-グルコース(0.991 g/L)を組み合わせて取り込みバッファーを調製します。NaOHでpHを7.4に調整し(ナトリウム濃度は約130 mMになります)、氷上に保ちます.
手記：2つの脳について、1500mLの取り込みバッファーを調製します。アスコルビン酸とグルコースを含まない10倍ストック溶液として取り込み緩衝液を調製し、4°Cに保たせます。アスコルビン酸とグルコースを補給して、当日新たに1xワーキング溶液を作ります。NaOHでpHを7.4に調整します。
- 25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1 mM アスコルビン酸(0.194 g/L)、5 mM D-グルコース(0.991 g/L)、1 μM pargyline、100 nM desipramine、10 nM Catechol-O-methyl-transferase(COMT)阻害剤を組み合わせて、取り込みバッファー+リガンドを調製します。NaOHでpH 7.4に調整し、氷上に保ちます.
手記：50 mLの取り込みバッファーを使用し、リガンドを添加します。パルギリンは、モノアミンオキシダーゼ(MAO)による酸化によるDAの分解を防ぐために添加されます。COMT阻害剤(RO-41-0960)は、COMTによるDA(一般的にカテコールアミン)の分解を防ぐために添加されます。デシプラミンは、ノルエピネフリンおよびセロトニントランスポーターを介した取り込みを阻害するために添加され、それによって取り込み結果をドーパミントランスポーター(DAT)に特異的にします。
- 25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1 mM アスコルビン酸(0.194 g/L)、5 mM D-グルコース(0.991 g/L)、1 μM pargyline、100 nM desipramine、10 nM COMT inhibitor、500 μM cocaine を組み合わせて、取り込みバッファー + リガンド + コカイン(coc)を調製します。NaOHでpHを7.4に調整し、氷上に保ちます.
手記：7 mLの取り込みバッファー+リガンドを使用し、コカインを添加します。コカインを添加して、データから差し引く非特異的なDA取り込みのバックグラウンド測定値を取得し、DAT特異的な取り込みのみを残します(上記のように、SERTとNETはデシプラミンによって阻害されるため)。あるいは、非常に強力で特異的なDAT阻害剤GBR-12935を代わりに使用することもできます
重要:これからはすべてを氷の上に置いてください。
- シナプトソーム調製
- 一度に1匹のマウスを頸椎脱臼と斬首によって犠牲にします。
- ハサミを使用して皮膚を切断して頭蓋骨を露出させ、斬首によって残った頭蓋骨の後部の余分な組織を切り取ります。矢状結節に沿って小さなまっすぐなハサミで頭蓋骨を切り、できるだけ前方に終わります。
- マウスの両目に2本のハサミの先端を置き、頭蓋骨を切り抜いて、頭蓋骨の残りの部分と無傷の脳を取り除きます。脳を迅速に取り出し、氷のように冷たいPBSに入れます。これにより、第二の脳が解剖されている間、冷たく保つことができます。
- 脳マトリックスを使用して、線条体の3 mmの冠状スライス(前後:+ 1.5 mm〜-1.5 mm)を解剖し、続いてパンチャーでより細かく解剖します。パンチ領域については、図 1 を参照してください。
- 前進するときは、常にティッシュを氷の上に置いてください。
- 組織を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移し、計量します.
手記：このウェイトは、ステップ 1.2.14 で使用されます。
- 2 番目の脳に対して手順 1.2.1 から 1.2.6 を繰り返します。
- 両方の脳の重量が得られたら、組織を1 mLの氷冷ホモジナイゼーションバッファーを含むホモジナイゼーショングラスに移します。
- モーター駆動の乳棒を使用して、800 rpm、10回の均一なストロークで組織を均質化します。
手記：1 ストロークは 1 回の上下動作に相当します。最初のストロークは約5秒、次のストロークは3〜4秒である必要があります。等張培地での均質化は、シナプトソームの破裂を防ぐために重要です。適切な力と等張媒体を使用すると、シナプス前末端が細胞質、シナプス小胞、ミトコンドリア、および細胞骨格を囲むように再シールすることができます。
- ホモジネートを1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移し、ホモジナイゼーションガラスから残りのホモジネートを0.5 mLの追加ホモジナイゼーションバッファーですすいで
回収します。
- サンプルを氷上に保ちながら、もう一方の脳の組織を均質化します。手順 1.2.12 から 1.2.13 で 2 つの頭脳を並列に実行します。
- 核と細胞破片を遠心分離(1,000 x g、10分、4°C)でペレット
化します。
- 上清(S1)(細胞膜と細胞質を含む)を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移し、16,000 x gで4°Cで20分間遠心分離します。
- 上清(細胞質を含む)を捨て、ペレット(P2)(粗シナプトソームを含む)を40 μLの均質化バッファー/ mg組織(ステップ1.2.6で得られた重量に基づく)に再懸濁します。力を入れすぎるとシナプトソームが壊れるので、粗いシナプトソーム画分をp1000ピペットで穏やかに再懸濁します
手記：最終的には少なくとも280μLにすることが重要です。そうでない場合は、mg あたり 40 μL 以上で希釈する必要があります。ステップ1.2.1-1.2.13はできるだけ早く実行する必要があり、すべてを氷の上に保つ必要があります。粗シナプトソームが均質化バッファーに再懸濁されるとすぐに、氷上に保持されている限り、かなり安定しています。
2. 取り込み実験
- 440 μL 取り込みバッファー + リガンド + コカインを指定の 1.5 mL マイクロ遠心チューブ 12 本に、残りの 36 本の 1.5 mL マイクロ遠心チューブに 440 μL 取り込みバッファー + リガンドを加えます (レイアウトについては表 1 を参照)
手記：実験開始の15分前に氷から取り出して室温に戻しますが、それまではインヒビターを節約するために氷の上に置いておきます。
- 飽和曲線(ドーパミン(2,5,6-[3H]-DA)(3-Hドーパミン)(91.1 Ci/mmol))を各種最終濃度(0.031、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 μM))で調製します。
- 6本の2 mL微量遠心チューブに10、5、2.5、1.25、0.62、および0.31とラベル付けします。
- 750 μLの取り込みバッファー+リガンドを、最も低い番号の5本の微量遠心チューブに加えます。
- 1,455.4 μLの取り込みバッファー+リガンド、14.6 μLのドーパミン(1 mM)、30 μLの3-Hドーパミン(11 μM)を、10とラベル付けされたチューブに加えます。
- 10とラベル付けされたチューブから750μLを5とラベル付けされたチューブに移します。よく混合し、このチューブから750μLを2.5チューブに移します。残りのチューブでこの希釈を繰り返します。
- ガラスマイクロファイバーフィルターを12ウェルフィルターバケツに置いた後、4 mLの取り込みバッファーで事前にすすぎます。
- 440 μLのバッファーを含む最初の24本の1.5 mLマイクロ遠心チューブ(レイアウトについては表1を参照)に、10 μLのシナプトソーム膜懸濁液を加えます。慎重にボルテックスし、シナプトソームがバッファーに沈んでいることを確認するためにすぐにスピンダウンします。37°Cで10分間放置します.
手記：脳間の公平な比較のために、取り込み実験中の時間を正確に把握することが重要です。精度のためにストップウォッチを使用してください。
- 濃度10および5 μMのドーパミン50 μL(セクション2.2)を最初の2つのカラムに加え、振とうしながら37°Cで5分間放置します。ちょうど5分後、1 mLの氷冷取り込みバッファーを加えて反応を停止します。濃度 2.5 および 1.25 μM (セクション 2.2) で同じことを行い、次に濃度 0.62 および 0.31 μM で同じことを行います。
- サンプルをすすぎ済みのマイクロファイバーフィルターに加え、5 x 4 mLの氷冷取り込みバッファーで洗浄します。最初の12個のサンプルをフィルターに追加したら、フィルターをシンチレーションチューブに移動します。次の 12 個のサンプルでこれを繰り返します。
- 次の脳に対して手順2.4〜2.6を繰り返します。
- シンチレーションチューブ49-51の底部にマイクロファイバーフィルターを配置し、その上に最大ドーパミン濃度の25μL(10μM)を加えて、3本のマックスカウントチューブを準備します。
- 51本のシンチレーションチューブすべてをドラフトに1時間放置します。
- 各シンチレーションチューブに3mLのシンチレーション液を加え、シェーカーで1時間激しく振とうします。
- ベータカウンターで[3H]-DAを1分間カウントします。
- ラベル:H-3、プレート/フィルター:4 mLバイアル、4 x 6、アッセイタイプ:正常、計数時間:1分
手記：この手順は、都合が良ければ翌日に実行できます。サンプルを錫箔で一晩覆しておきます。
- タンパク質の測定
- 標準的なBCAタンパク質アッセイキットを使用して、シナプトソームのタンパク質濃度を測定し、カウント/分(cpm)からfmol/min/μgまで調整し、サンプル間の取り込みを適切に比較します。
3. データ分析
- 取り込み実験のデータを使用して、各グループの飽和曲線を作成し、反応速度(Vmax)とMichaelis Menten定数(KM)を計算します
手記：K M値は、Vmaxの半分に達するために必要な基板濃度を反映しています。したがって、VmaxはDAT(最大取り込み容量)の機能を直接反映しており、これは表面上のDATの数と、その活性が翻訳後修飾や相互作用タンパク質、およびイオン勾配の変化によってどのように調節されるかに依存します。KM値は、トランスポーターに対する基質親和性の間接的な尺度であり、重要なことに、翻訳後修飾および/または相互作用タンパク質によっても調節できます。したがって、機能変化を完全に評価するには、例えば表面ビオチン化アッセイによって表面発現レベルを直接決定することが重要です。
表1:シナプトソーム調製用の微量遠心チューブレイアウト。
名
名
名
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10+コック | 5+コック | 2.5+コック | 1.25+コック | 0.62+コック | 0.31+コック |
