可視化のためのラット海馬スライスにおけるビオシチン充填介在ニューロンの標識

要約

出典: Economides, G., et al. Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオは、ビオシチンで満たされた介在ニューロンを含む固定ラットの脳スライスを染色する手順を示しています。このプロトコールには、アビジン-ビオチン複合体(ABC)によるインキュベーション、HRPおよび発色基質による染色、四酸化オスミウムによる構造の保存、およびイメージングのための樹脂への組織包埋が含まれます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています

1. カルシウム結合タンパク質または介在ニューロンのタンパク質含有量の測定と電気生理学的記録およびバイオサイトン充填後のバイオサイトンの可視化

注:電気生理学的記録の最後に、ビオシチンで満たされた細胞を含むスライスは、組織学的処置の前に一晩固定されます。固定液は、組織の損傷を防ぐために、残りの手順を別の日に実施する場合、翌朝に0.1 Mリン酸緩衝液の1回の交換で交換されます。固定液(4%パラホルムアルデヒド、0.2%飽和ピクリン酸溶液、0.1 Mリン酸緩衝液(PB)中の0.025%グルタルアルデヒド溶液)は、最良の結果を得るために、記録日に新鮮にする必要があります。

1. 電気生理学的記録の最後に、記録された細胞を含むスライスを絵筆で慎重に拾い上げ、人工脳脊髄液(ACSF)が入ったポットに入れます
   手記：鋭利な電極を用いたスライス調製および細胞内記録に使用されるプロトコールの詳細は、以前に説明した。
2. ドラフトで、ペイントブラシで脳のスライスを慎重に拾い上げ、上質な濾紙の小さな部分に転がします。湿らせた濾紙をスライスの上に置き、湿らせた濾紙2枚を5〜10 mLの固定液が入った小さなプラスチックポットに入れ、冷蔵庫で4°Cで一晩保存します。
3. 蒸留水にゼラチンの溶液を調製します。ホットプレートのビーカーに蒸留水20mLを入れ、60°Cに加熱します。ゼラチン2.4gを水に徐々に加え、溶解するまで待ち、35〜40°Cに冷ましてから組織の損傷を防ぎます。
4. 固定液を2mLの0.1 M PBと交換します。スライスをペトリ皿に入れ、メスの刃で余分な組織を切り取ります。トリミングしたティッシュをシャーレ(直径9 cm、高さ1.4 cm)に置き、折り目やしわがなく平らになっていることを確認し、乾いた絵筆を使用して余分なバッファーを取り除きます。
5. 組織を温かいゼラチン溶液で覆い、ペトリ皿を冷凍ブロックの上に置いて、溶液をすばやく冷却します。
6. コントラストを提供するためにアングルポイズランプを使用して、皿の側面を覗き、ゼラチンが固まり始めるまで細い絵筆からの軽い圧力を使用してスライスを平らに保ちます
   手記：ゼラチンは、組織が平らでない場合、再溶解することができます。絵筆が固まるときに絵筆が取り除かれることによって生じるゼラチンの表面の欠陥は、ランプの電球を表面に数秒間近づけて表面層を穏やかに溶かすことによって取り除くことができます。
7. ゼラチンをセットした皿を冷蔵庫に移し、4°Cで30〜60分間放置します。
8. ドラフトで、メスの刃を使用して皿のゼラチン包埋組織を含む小さなブロック(~1 x 1 cm)を切り取り、小さなヘラを使用してブロックを持ち上げ、スライスを固定するために使用したのと同じ新鮮な固定液に慎重に置き、4°Cで少なくとも30分間
。
9. ゼラチンブロックを0.1M PBの5mLで3回洗浄し、ペーパーティッシュを使用して乾燥させ、ブロック面を上にして(つまり、ティッシュを上部にして)瞬間接着剤を使用してビブラトームチャックに貼り付けます。
10. 濾紙で余分な接着剤を取り除き、メスの刃を使用してブロックの角を切り取り、ひし形にします。
11. ビブラトームを使用して50μmの厚さでスライスを切片にし、10%のスクロースを含むガラスバイアルに各切片を慎重に置きます。
12. バイアルからセクションを慎重に取り出し、ペトリ皿の蓋に平らに置きます。解剖顕微鏡と新鮮なメスの刃を使用して、切片の周囲からゼラチンを取り除き、切片を新鮮な10%ショ糖
    2mLが入ったバイアルに戻します 手記：この段階では、脱水ステップ中の組織の収縮を減らすために、できるだけ多くのゼラチンを除去することが重要です(ステップ1.37)。
13. 0.1 M PBベースのスクロース-グリセロール溶液中の切片を室温で凍結保護するには、10%ショ糖溶液で10分間、20%ショ糖-6%グリセロール溶液で20分間2回、最後に30%ショ糖-12%グリセロール溶液で30分間、一定の撹拌下で2回インキュベー
トします。
14. ペイントブラシを使用して、セクションを小さな長方形の錫箔に平らに置きます。セクションから余分な液体を取り除き、錫箔を慎重に小包に折ります。
15. 小包を液体窒素の表面に触れずに30秒間保持し、その後、約30秒間完全に解凍します。凍結融解をさらに2回繰り返します。
16. 絵筆ですべての切片を取り除き、2 mLの0.1 M PBが入ったガラスバイアルに入れ、絶えず攪拌して余分なショ糖を洗い流します。
17. パスツールピペットでPBを取り出し、切片を1%過酸化水素水溶液(H₂O₂)の2 mLで30分間インキュベートします。切片を0.1 M PBの2 mLで3×5分間洗浄します。
18. パスツールピペットで0.1 M PBを取り外し、0.1 M PB.
    に1%水素化ホウ素ナトリウム(NaBH₄)を加えます 手記： NaBH₄溶液は水素ガスを放出するため、バイアルに蓋をしないでください。
19. パスツールピペットで水素化ホウ素ナトリウムを取り出し、切片を2 mLの0.1 M PB 5x 5分間で十分に洗浄します。
20. 0.1 M PBを10%正常ヤギ血清(NGS)と0.1 M PBで30分間交換します。
21. ヤギ血清を取り出し、ABC溶液で調製したマウスモノクローナル抗体とウサギポリクローナル抗体の混合物で切片を4°Cで一晩インキュベートします
    手記：以前の研究で使用された一次抗体のリストを表1に示します。
22. 切片を暗所で2時間インキュベートし、蛍光標識二次抗体の混合物で調製します(材料表)。
23. 封入剤でスライドに切片を取り付け、カバースリップで覆います。
24. 40倍の倍率で蛍光標識の画像を撮影します(図1Bb)。
25. 蛍光イメージング後、スライドをPBSの入ったガラスシャーレに入れ、カバースリップを慎重に取り外します。次に、パスツールピペットからPBSの穏やかなパルスを使用して、スライドから切片を洗い流します。切片をPBSを含む清潔なガラスバイアルに入れます。
26. まず、ABCの切片を少なくとも2時間インキュベートしてHRP反応生成物を増幅することにより、アビジン-HRP反応を行います。
27. 5mLの蒸留水に1錠を加えて、3,5ジアミノベンジジン(DAB)溶液を調製します。
28. 切片をPBSで10分間3回洗浄し、次にTrisバッファーで10分間2回洗浄します。
29. 8 % NiCl₂(塩化ニッケル)溶液を 1 滴DAB溶液にすばやく加え、溶液をピペットで出し入れして混合し、この溶液1 mLを切片にすばやく加えます。DAB/NiCl₂溶液中の切片を15分間インキュベートします。
30. 10 μL の 1% H₂O₂ を DAB 溶液に加えます。約1〜2分間、一定の攪拌下で暗闇で反応を進行させ、充填された細胞の標識を解剖顕微鏡で監視します。
31. DAB/NiCl₂/H₂O₂溶液を除去して反応を停止し、切片をTrisバッファーで5分間2回洗浄します。
32. ドラフトに小さな円状の濾紙をペトリ皿に入れ、0.1 M PBで湿らせます。絵筆を使用してガラスバイアルから一度に1つずつセクションを持ち上げ、紙の上に慎重に平らに置きます。
33. セクションを湿らせた別の濾紙の円で覆い、ティッシュペーパーを表面にそっと触れて余分なバッファーを取り除きます。
34. 0.1 M PBに1%四酸化オスミウムを8〜9滴垂らし、皿を覆い、ヒュームフードに少なくとも30分間、1時間以内
保持します。
35. ペトリ皿を開き、上部の濾紙を持ち上げます。絵筆で切片を1つずつ慎重に持ち上げ、ガラスのバイアルに入れ、蒸留水で2回すすぎます。
36. 四酸化オスミウム廃棄物は適切に処理してください。すべての使い捨て機器をすすぎ、適切なビンに入れます。
37. 各セクションをスライドガラスに平らに置き、セクションを覆います。スライドをペトリ皿に移し、空のガラスバイアルをカバーガラスの上に置き、所定の位置に保持し、50%アルコールで覆います。15分後、溶液からスライドを取り出し、スライドから切片を取り除きます。セクションをスライドに戻し、スライドを70%アルコールに15分間置きます。95%、最後に100%のアルコール溶液で同じプロセスを繰り返します。
38. 脱水ステップに続いて、ヒュームフード内のシェーカーで100%アルコールの入ったガラスバイアルに切片を移します。アルコール溶液をプロピレンオキシド(C₃H₆O)と交換し、5分間3回洗浄します。最後の洗浄後、バイアルに~2 mLのプロピレンオキシドを保持し、レジンを添加します(1:1の比率)。樹脂が溶解していることを確認し、切片を30分間一定に攪拌します。
39. エポキシ樹脂を配合したアルミ製のプランシェットに木の棒で各切片を置き、一晩インキュベートします
    注:レジンに損傷を与えるリスクを避けるため、レジンに24時間以上放置しないでください。
40. プランシェットをホットプレートの上に約10分間置き、木の棒で各セクションを持ち上げ、きれいな滑り台に置きます。解剖顕微鏡を使用して、各セクションの向きを一定に保ちます。セクションにカバースリップを置きます。スライドをオーブンに56°Cで48時間置き、硬化させます。

表1:解決策の表。

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使用したソリューション	構成/指示
固定ソリューション	4% パラホルムアルデヒド、0.2% 飽和ピクリン酸溶液、0.025% グルタルアルデヒド溶液、0.1 M リン酸緩衝液 (PB)
0.1M リン酸バッファー pH 7.6	100 mLのストック1 Mリン酸バッファーを900 mLの蒸留水に加えます
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH 7.4 / 7.5	0.1 Mリン酸緩衝液10 mL、KCl0.2 g、NaCl 8.76 gを990 mLの蒸留水に加えます
TRIS緩衝液 pH 7.5	5.72 gのTris Hydrochlorideと1.66 gのTris Baseを50 mLの蒸留水に溶解します。次に、蒸留水で最大1リットルを作ります。
緩衝型グルタルアルデヒドおよびパラホルムアルデヒド固定液	4% パラホルムアルデヒド、0.2% 飽和ピクリン酸溶液、0.025% グルタルアルデヒド溶液、0.1 M リン酸緩衝液溶液溶液。
ABCソリューション	溶液は、ABCキットから使用の少なくとも30分前に作成する必要があります。1滴の溶液Aと1滴の溶液Bを2.5mLのPBSに加えます。
Durcupanエポキシ樹脂:	20ポットを作るには:20 gのコンポーネントA、20 gのコンポーネントB、0.6 gのコンポーネントC、0.4 gのコンポーネントD-
	プレートを濾紙の円で覆うことにより、天びんをこぼさから保護します。試薬を上記の比率でトリッパービーカーに慎重に計量します。2本の木の棒を使って少なくとも5分間激しく攪拌して完全に混ぜます。混合物は均一な密度の暗褐色になるはずです。ビーカーを~50°Cのオーブンに最大10分間入れて、できるだけ多くの気泡を取り除きます。手記： ビーカーをオーブンに10分以上置いておくと、樹脂が硬化し始めます。レジンをプラスチックポットまたは5 mLシリンジにデカントし、日付を記入し、-20°Cの冷凍庫ですぐに使用できます。

結果

図1: 海馬CA2領域に記録され充填された2種類のバスケット細胞のニューロン再構成と、細胞内記録in vitroに続いて得られた相関電気生理学的データ。この数値は、以前の研究から修正されています。SO Stratum Oriens、SP Stratum Pyramidale、SR Stratum Radiatum、SLM Stratum Lacunosum Moleculare。(A)Aa:ドローイングチューブ(1000X)を使用した、制限された樹状突起および軸索アーバーを備えたCA2バスケットセルの再構築。樹状突起は黒、軸索は赤です。Ab:ここに記載されているアビジン-HRPプロトコルに従ったビオシチン充填バスケット細胞の画像。AC:樹状突起および軸索アーバーが制限されたCA2バスケットセルの過分極および脱分...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アビジン-7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸(アビジン-AMCA)抗体-20.8 mg/mL	ベクターラボ	A2008
ビオシチン≥98%(TLC)	シグマ	B4261
3,5ジアミノベンジジン(DAB)錠剤、5mLを調製する	シグマ	D4293
Durcupanエポキシ樹脂A	シグマ	44611
Durcupanエポキシ樹脂B	シグマ	44612
Durcupan エポキシ樹脂 C	シグマ	44613
Durcupan エポキシ樹脂 D	シグマ	44614
エタノール、純度、絶対、≥99.8%	シグマ	32221
ゼラチン	シグマ	48723
グルタルアルデヒド溶液、グレードI、H2O中25%	シグマ	G5882
グリセロール、≥99%	シグマ	G5516
ヤギ血清	シグマ	G9023
ヤギ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-14.3 mg / mL	シグマ	F2653
ヤギ抗ウサギテキサスレッド(TR)-3.3 mg / mL	インビトゲン	T2767
過酸化水素、30%溶液	シグマ	H-1009
浸漬油、粘度1.250 cSt(点灯)	シグマ	I0890
塩化ニッケル	シグマ	N5756
四酸化オスミウム、電子顕微鏡用、4% 水溶液	シグマ	75632
パラホルムアルデヒド、試薬グレード、結晶性	シグマ	P6148
ピクリン酸、水で湿らせた、≥98%	シグマ	197378
リン酸緩衝液 1 M	シグマ	P3619
プロピレンオキシド、99%	アルファ・アエサル	30765
テトラヒドロホウ酸ナトリウム	VWRの	27885.134
蔗糖	フィッシャーサイエンティフィック	S/8600/53
トリズマ塩酸塩、≥99.0%	シグマ	T5941
トリズマベース、≥99.9%	シグマ	T6066
Vectashield 色あせ防止封入用メディウム、屈折率 1.45	ベクターラボ	H-1000
ベクタステインエリートABC HRPキット	ベクターラボ	PK6100
使用機器
ビブラトーム	寒天科学
C4Aカップアルミニウムプランシェット	GA-MA & ASSOCIATES, INC. (ガマ・アンド・アソシエイツ
ライカDMR顕微鏡	ライカマイクロシステムズ
X-Cite 120PC Q 蛍光光源	エクセリタス・テクノロジーズ
ライカDFC450デジタル顕微鏡カメラ	ライカマイクロシステムズ
ラピドグラフ製図ペン0.18mm	ロンドン・グラフィック・センター
0.18mmラピドグラフペン先	ロンドン・グラフィック・センター
ラピドグラフ製図ペン0.25mm	ロンドン・グラフィック・センター
0.25mmラピドグラフペン先	ロンドン・グラフィック・センター
PCワークステーション、ステージ、カメラ、XYZステージ制御用ジョイスティックを含むNeurolucidaシステム	Microbrighfield (MBF) バイオサイエンス
Neurolucidaソフトウェアバージョン2017	Microbrighfield (MBF) バイオサイエンス
CorelDRAW グラフィックス スイート X5	コーレル
動画編集ソフト	アドビプレミアプロ
ガラスバイアル14 mL	フィッシャーサイエンティフィック

年度 の 型 )