放射状運動アッセイを用いたC.エレガンスモデルにおける運動障害の評価

要約

出典:Currey, H. N., et al. Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオは、野生型またはALS変異型のヒトTDP-43タンパク質を発現するC.エレガンスの運動機能障害を評価するための放射状移動アッセイの使用を示しています。野生型または変異型のTDP-43発現レベルが異なる線虫は這うことができ、その動きはアッセイプレートの中心点から移動した半径方向の距離によって測定されます。このアッセイは、さまざまなC.エレガンス株の移動距離に基づいて、軽度、中等度、および重度の運動障害を区別します。

プロトコル

1. 放射状移動アッセイ

1. 直径100mmまたは150mmのシャーレを約半分に線虫増殖培地(NGM)で満たし、OP50細菌の均一な芝生を播種して寒天の全面を覆います。
2. NGMアッセイプレートを逆さまにし、底面にアッセイするC.エレガンス株の識別子(株あたり2プレート)をラベル付けします(図1A)。
3. 逆さまのプレートの中央にマーカーを付けて小さな点を作ります(図1A)。
4. 解剖顕微鏡で作業しながら、プラチナワイヤーピック(図1B)を使用して、15〜20段階の段階的一致した線虫をアッセイプレートの中心に真上(NGMで見える)の中心ドットに移します(図1B).
   手記：すべてのワームを同時に、またはできるだけ早く転送してみてください。
   1. プレートの中央にワームを配置してから30分後にタイマーをセットします。蓋をプレートに戻し、脇に置きます(図1C)。
5. すべての菌株が指定されたアッセイプレート上に到達するまで線虫の移し替えを続け、プレート間の移管に要するおよその時間を記録します(プレート間を~1分を目安にしてください)。すべてのプレートをセットアップされた順序と同じに保ちます。
6. 30分後、最初のプレートのスコアリングを開始します。
   1. 蓋を取り外し、プレートのラベル付き裏面が上を向き、NGM寒天が視線と線虫の間にくるように、プレートを下向きにして解剖顕微鏡の下に置きます。プレートは通常の使用から逆さまになります。
   2. 寒天を通して線虫が見えるまで、顕微鏡の焦点を調整します。
   3. 中心点から異なる色のフェルトペンを使用して、各ワームの位置に小さな点を置きます - 最も遠位の動物を見つけるために細菌の芝生を通るワームの足跡をたどります。
   4. 一部のワームがそこに到達する可能性がありますので、プレートの端を確認してください。また、中心点ドット内のワームの数をカウントして記録します(図1D)。
7. すべてのアッセイプレートの活動時間が30分になるように、すべてのアッセイプレートを順番にマーキングし続け、プレートのセットアップにかかった時間を考慮して注意します。次に、ステップ1.8または1.9で説明したように、手動またはデジタル測定を実行します。
8. 定規を使用して手動測定を実行します。
   1. 定規を使用して、各ワームの中心点から最終的な位置マーキングまでの距離をmmで測定し、距離を記録します。スコアリング中の進行状況を追跡するために、最初にスコアリングされたポイントに小さなマーキング線でラベルを付けます。
   2. プレートを時計回りに回転させることにより、各ドットの長さデータを連続して記録します(図1E)。
9. スキャナーとImageJを使用してデジタル測定を行います。
   1. フラットベッドスキャナーを使用して、定規(スキャン面に面した数字)の横にあるアッセイプレートの背面をスキャンします(図2A)。
   2. スキャンしたプレート画像をImageJまたは同様のプログラムで開きます.
      手記：ImageJ は、NIH がホストする無料の Java ベースの画像処理ソフトウェアです。
   3. [直線ツール]をクリックし、定規のスキャン画像に1cmと2cmの点を結ぶ線を引きます(図2B).
      手記： Shiftコンピュータキーを押したままにすると、ラインが最も近い45°の角度に強制されます。
   4. [分析] メニューに移動し、それを使用してスケールを設定します ([分析] |スケールの設定) (図 2C)。
   5. 適切なボックスに既知の距離(10)と長さの単位(mm)を入力し、距離をピクセル数で調整しないでください。[グローバル] をオンにすると、各 ImageJ セッションで解析されるすべての画像に同じスケールが適用されます。それ以外の場合は、開いたときに各画像のスケールを設定します(図2D)。[OK.
      ] をクリックします。 手記：手順1.9.2〜1.9.5を実行して、測定スケールを設定します。この画像の測定値は、線の長さを定義されたピクセル:長さの関係に自動的に関連付けるようになりました。300 dpi でスキャンされた画像は、約 11.8 ピクセル/mm の関係を持ちます。
   6. ペイントブラシツールを使用して、最初に得点するポイントのすぐ上にマークを付けます.
      手記：これは、最初にスコアリングされたワームの視覚的なインジケーターです。
   7. 直線ツールを使用して、中心点から最初のワームデータ点まで線を引きます。
   8. キーボードのMキーをクリックして、距離を測定します。または、[分析] メニューに移動し、[測定] ([分析] |メジャー)。どちらの場合も、測定値は新しいウィンドウに表示されます。このウィンドウは、画像ごとにすべての測定値を収集します。
   9. 中心点を一定に保ちながら、最初のワーム点に接する線の端を次のワーム点に移動し、時計回りに移動し、Mキーをクリックして測定します。
   10. すべてのポイントが得点されるまで、時計回りに各ポイントを測定し続けます。
   11. 長さ測定データをコピーしてスプレッドシートに貼り付けて保存します。次に、スキャンしたプレート画像ごとにこのプロセスを繰り返します.
       手記： ステップ1.9.6〜1.9.11では、ワームの変位値を測定します(図2E-F)。
10. 統計分析を実行します。
    1. 1 つの実験内で反復を組み合わせ、スコアリングされた合計数が 30 から 40 の線虫になるようにします。
    2. 異なる日に、独立した線虫の集団で独立した実験反復を行い、最終的に 3 つの独立した実験反復を行います。
    3. 2つの系統のスチューデントのt検定や3つ以上の系統の1因子分散分析など、適切な統計分析を使用してデータを分析します。

結果

図1:ラジアルロコモーションアッセイのワークフロー。パネル A-E は、放射状ロコモーション アッセイの一般化されたステップを示しています。(A) NGM プレートは、端に OP50 が播種され、中央のドットにラベルを付けてマーキングすることによって調製されます。(B は、中央のドットでマークされた寒天の中央にワームが配置され、(C は、ワームが一定時間自由に動くことができます。 (D) プレートを下上に反転させ、各ワームの最終的な位置を中央のドットとは異なる色でマークします (E) 中央のドットから各最終的なワームの位置までの距離を手作業またはデジタルで測定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C.エレガンス	カエノーラブディティス遺伝学センター(CGC)	-	必要に応じてあなたの株を取得してください、N2は有用な制御株です
使い捨てパスツール・ピペット、ホウケイ酸ガラス	VWRの	14673から010	ワームピックの作成に使用されるガラスピペット - 片手でガラスピペットを持ち、もう片方の手で~1インチのプラチナワイヤー(ペンチで保持)を炎の上に持って結合します。
使い捨てシャーレ、35x10mm	VWRの	10799-192	WormLabイメージングシステム用アッセイプレート
使い捨てシャーレ、60x15mm	VWRの	25384-090	ウォーム用ストックプレート
使い捨てシャーレ、100x15mm	VWRの	25384-302	標準ラジアルロコモーションアッセイプレート
使い捨てシャーレ、150x15mm	VWRの	25384-326	より長い時間枠のラジアルロコモーションアッセイプレート
解剖顕微鏡	ライカ	M80	線虫のメンテナンスと放射状移動アッセイの設定の範囲
先端の細いマーカー	VWRの	52877から810	放射状ロコモーションアッセイには少なくとも2色が必要です。精度のために必要な細かいヒント。
フラットベッドスキャナー	アマゾン	エプソンパーフェクションV850	ラジアルロコモーションアッセイのオプション。プロトコルは300dpiの解像度を前提としており、ほとんどのスキャナーは正常に動作します
NGM(線虫増殖培地)	VWRの	76347から412	C.エレガンスの栽培に使用される媒体。一から作ることができます、WormBook:C.エレガンスのメンテナンスを参照してください
OP50バクテリア	カエノーラブディティス遺伝学センター(CGC)	OP50	C.エレガンスの主な食料源
P1000ピペッター	VWRの	76207-552	Pipettor、水泳アッセイに使用
P1000のヒント	VWRの	83007-384	ピペッターのヒント、水泳アッセイに使用
プラチナ線、直径0.2032mm	VWRの	BT136585-5M	ワームピックを作成するために使用されるファインゲージのプラチナ線 - 片手でガラスピペットを持ち、もう片方の手で~1インチのプラチナワイヤー(ペンチで保持)を炎の上に持って結合します。
ルーラー	VWRの	〒56510-001	放射状ロコモーションアッセイのスコアリングが必要
イメージJ	NIHの	-	オプションのフリーソフトウェアの提供元 NIHの - https://imagej.nih.gov/ij/
WormLabイメージングシステム	MBFバイオサイエンス	ワームラボ	イメージングシステムには が含まれます WormLabハードウェア(明視野 ステージ、カメラ、ハウジング) およびWormLabソフトウェア。https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- 制