動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1. 準備
- 組織調製と切片化
- ラットを新鮮/生理食塩水(SAL;0.9%NaCl)、接頭辞付き/SALおよび接頭辞/3,4-メチレンジオキシメタンフェタミン(MDMA;表1の詳細を参照)の3つのグループにランダムに割り当てます。
- 1 ml / kg SALと10 mg / kg MDMAをそれぞれ腹腔内に3回投与します。2時間間隔でSALグループとMDMAグループに投与します。.動物が治療を6日間生き残るのを待ちます。
- 7日目に、100 mg / kgケタミンを5 mg / kgキシラジンと組み合わせてラット腹腔内に投与し、深い麻酔(つまり、角膜のまばたきと尾のつまわり反射の喪失)。.
- フレッシュ/SALグループの場合は、ラットをすばやく斬首し、フレッシュブレインテストのために脳を取り出します。
- 接頭辞付き/SALグループと接頭辞付き/MDMAグループの場合、胸骨に沿って約10〜12 cmの切り込みを入れてから、胸骨の端を露出させます。
- 胸骨の端を止血器で保持し、鋭利なハサミで横方向に横に切断し、次に肋骨を横切って肺と平行に上向きに切断します。
- 片手で、小さな鉗子で心臓の腹側先端を持ちます。もう一方の手で、18 Gシリンジ針で左心室を突き刺します(針のアダプター側は、氷冷SALおよびパラホルムアルデヒド容器と蠕動ポンプにY字型シリコンホースで接続されていることに注意してください)。
- 流速の中間レベル(~5 ml/分)でSALポンプをオンにし、鉗子で右心房に穴を開けて、戻り循環が逃げるようにします。SAL灌流を30分間維持します。
- パラホルムアルデヒドポンプを中レベルでオンにし、氷冷した4%パラホルムアルデヒドを動物に30分間灌流させます。
- 灌流器具を取り外し、動物の首を切り落とします。頭蓋骨の正中線を後方に切り込みを入れ、頭蓋骨をフラップして頭蓋骨の空洞を露出させます。
- 頭蓋骨腔からへらで脳を取り出し、25mlの4%パラホルムアルデヒドを含む50mlの遠心チューブに脳を入れます。パラホルムアルデヒド含有チューブ内に脳を4°Cの冷蔵庫で24時間保管します。
- 脳を25mlの30%スクロース溶液を含む50mlの遠心チューブに4°Cで3日間移動します。最後に、脳をビニール袋に入れて-80°Cで使用まで保管します。
- 埋め込みメディアを備えたチャックに脳を取り付け、脳を含む埋め込みメディアを-26°Cの温度でクライオスタットで凍結します。新鮮な凍結脳を20μmのセクションに、パラホルムアルデヒドプレフィックスの脳を10μmのセクションにカットします。スライドを切片に触れて、切片を室温(RT)顕微鏡スライドに移します。
- RTで4時間風乾し、セクションスライドを-80°Cの密閉袋に入れて使用まで保管します。
- 脱水
- -80°Cの冷凍庫からスライドを取り出し、切片を3つの試験のいずれかに割り当てます:セロトニン5-HT2A受容体遺伝子(ht2a)、ppiB(ペプチジルプロリルイソメラーゼB遺伝子、ポジティブコントロール)、またはdapB(細菌ジヒドロジピコリン酸還元酵素遺伝子、ネガティブコントロール)。ボールペンで切片に印を付けてラベルを付けます(鉛筆は使用しないでください)。スライドを100%アルコールに常温で5分間沈めます。スライドをドラフトで5分間乾燥させます。
- 前処理
- Pretreatment-1試薬(アルカリホスファターゼの不活性化)をスライド上の切片に20 μlピペットで移します。スライドをモイスチャートレイのラックレールに置きます(反応溶液からの蒸発を防ぐために、トレイは高湿度を維持するために蓋で覆われていることに注意してください)。
- 水平シェーカーで水分トレイを低速で10分間静かに振る スライドを二重蒸留水(ddH2O)で2回2分間洗浄し、150 mlの前処理-2試薬を含む200 mlビーカーにスライドを浸します(パラホルムアルデヒド固定によって誘発される架橋の切断)。スライドを100°Cで合計5分間煮沸します(RNA構造の熱誘起修復)。
- スライドをddH2Oで2分間2回洗浄し、スライドを100%アルコールに5分間入れ、ドラフト内でスライドを5分間乾燥させます。疎水性ペンを使用して、組織切片の選択した領域(例:図1で概説されている視床や視床下部などの非皮質構造)の周りに円を描きます。
- Pretreatment-3試薬10 μl(プローブの浸透性が増す)を選択した各領域にピペットで移し、水分トレイを蓋で覆います。水平シェーカーを装備したハイブリダイゼーションオーブンにトレイを置き、オーブンの温度を40°Cに設定します。トレイを30分間静かに振ってください。スライドをddH2Oで2分間2回洗浄します。
2. ハイブリダイゼーションとアンプリフィケーション
- 選択した領域に、それぞれ10 μlのhtr2a、ppiB、およびdapBプローブ試薬をピペットで貼り付けます。試薬の蒸発を防ぐために、水分トレイを蓋で覆います。低速にセットした横型シェーカーの上で優しく振る。スライドをオーブンで40°Cで2時間インキュベー
トします。
- スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄し、選択した各領域にAmplification-1試薬10 μlをピペットで入れ、スライドを振盪し、40°Cで30分間インキュベー
トします。
- スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄し、選択した各領域にAmplification-2試薬10 μlをピペットで移し、スライドを振盪し、40°Cで15分間インキュベー
トします。
- スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄し、選択した各領域にAmplification-3試薬10μlをピペットで移動させ、スライドを振盪し、40°Cで30分間インキュベー
トします。
- スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄し、選択した各領域にAmplification-4試薬10 μlをピペットで移動させ、スライドを振盪し、40°Cで15分間インキュベー
トします。
- スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄し、選択した各領域にAmplification-5試薬10 μlをピペットで入れ、スライドを振盪し、室温で30分間インキュベー
トします。
- スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄し、選択した各領域にAmplification-6試薬10 μlをピペットで移動させ、スライドを振盪して室温で15分間インキュベートします。スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄します。
3. 信号検出
- 選択した各領域に10 μlのRed試薬をピペットで移します(試薬はRed-BとRed-Aを1:60の比率で混合しているため、すぐに使用する必要があります)。スライドをRTの水平シェーカーの水分トレイに置き、低速で10分間静かに振とうします。
- スライドを(ddH2O)で10分間2回洗浄し、オーブンで60°Cのスライドを15分間乾燥させ、スライドをヒュームフードの下のキシレンに5分間入れます。選択した各領域にキシレンベースの封入剤20μlをピペットで取り、カバースリップで覆います。