マウス脳スライスにおける小脳プルキンエニューロンにおける長期うつ病の誘導

要約

出典:Yamaguchi, K., et al. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices.J. Vis. Exp. (2019)

この動画では、マウスの小脳スライスを用いて、運動制御に不可欠な平行線維、登山線維、プルキンエ細胞間のシナプス相互作用を調べました。クライミングファイバーの刺激は、プルキンエ細胞に長期うつ病(LTD)を誘発し、シナプス強度を弱め、平行線維刺激に対する反応を低下させました。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. ブレイン・スライシング

1. 小脳の背側が前面になるようにサンプルを向きます。小脳を完全に浸すのに十分な1μMのTTX(テトロドトキシン)を含む氷冷切断ACSF(人工脳脊髄液)を注ぎます。ACSFにガスチューブを入れ、O₂ / CO₂ガス混合物でバブリングを開始します。
2. 双眼鏡の下の細いピンセットを使用してくも膜下を取り外します。小脳脚を刃物で切り、脳幹と寒天ブロックを切除します。トレイを180°回転させて、小脳の背側がカミソリの刃を向くようにします。
3. ブレードをセットし、最初の切断位置を調整します。ビブラトーム スライス パラメーターを次のように設定します: 振幅を 5.5、周波数を 85 Hz、速度を 3–4、スライスの厚さを 300 μm に設定します。
4. ナイロンネット上の小脳スライスをアクリルインキュベーターに移し、スライスを酸素化されたACSFに完全に浸します。インキュベーターは、26°Cの温度を維持する水浴に入れる必要があります。
5. スライス中の損傷から回復できるように、スライスを少なくとも1時間保管してください。

2. 全細胞パッチクランプ記録

注:パッチクランプ記録には、赤外線微分干渉コントラスト(IR-DIC)光学系を備えた直立顕微鏡、パッチクランプ増幅器、データデジタイザ、デジタル刺激装置、アイソレータ、コンピュータ、データ収集および分析用ソフトウェア、電動マニピュレータ、顕微鏡プラットフォーム、防振テーブル、ファラデーケージ、溶液加熱システム、蠕動ポンプ、および電極プーラーが必要です。

1. ピクロトキシン(0.1mM)をACSFに添加し、超音波処理を用いて3分間分解する。
2. ピクロトキシン含有O2-CO2飽和ACSFで記録チャンバーを2 mL/分の速度で灌流し、記録チャンバーの温度を約30°Cに保ちます。
3. フィラメント(外径=1.5mm)のホウケイ酸ガラスキャピラリーを4段のプーラーで引っ張り、記録電極を作製します。先端径は1μm程度としてください。
4. 同じキャピラリーをプーラーで2段引っ張って刺激電極を作り、双眼顕微鏡で鉄ブロックに先端を打ち付けて先端を折って細い先端を作ります。最終的な直径は3〜5μmである必要があります。
5. 小脳スライスを記録チャンバーに移し、ナイロン糸でPtウェイトで固定します。刺激電極にACSFを充填します。
6. PFを刺激するには、刺激電極を分子層の表面、プルキンエ細胞層から約50μm離して配置します。
7. CFを刺激するには、刺激電極をプルキンエ細胞層の底に配置します(ステップ3.3、3.4)。
8. 0.45μmフィルターを備えたK⁺ベースまたはCs⁺ベースの内部溶液をフィルタリングします。マイクロローダーを使用して、記録電極に8μLの内部溶液を充填します。
9. 記録電極をACSFに浸す前に、記録電極に弱い正圧を加えてください。その抵抗は2〜4MΩで、液体の接合電位を補正する必要があります。
10. PCの健康で明るい細胞体に記録電極で近づきます。プルキンエセルの表面をわずかに押し、正圧の適用を停止し、次にギガオームシールが形成されるまで負圧を適用します。次に、負圧を使用して細胞全体の構成を確立します。
11. 膜電位を-70mVに保持し、0.1Hzで-2mVのパルス(持続時間、100ms)を印加して、入力抵抗、直列抵抗、および入力容量を連続的に監視します。直列抵抗補償は使用しないでください。直列抵抗が15%以上変動する場合は、データを破棄します。

3. LTDの誘導(長期うつ病)

1. パルス(持続時間、0.1ms)で分子層を刺激します。PF(Parallel Fibers)-興奮性シナプス後電流(EPSC)を、ダブルパルス刺激(50 msのスパイク間インターバル(ISI))を印加して同定します。PF-EPSC は、対パルスの促進と、刺激強度の増加に対する振幅の緩やかな増加を示す必要があります。
2. 0.1 Hz で 1 パルスを印加して PF-EPSC のテスト応答を記録し、誘発される EPSC 振幅が約 200 pA になるように刺激の強度を調整します。電圧依存のイオンチャネルを流れる電流の汚染を避けてください。
3. プルキンエ細胞層の底部にあるCFを刺激し、CF活性化によって誘発されるEPSCを特定します(ダブルパルス刺激を適用することにより)。CF-EPSC は、刺激強度の増加に応じて、ペアパルス抑制とオール オア ナッシングの方法を示す必要があります。LTD誘導では、単一の刺激を使用する必要があります。
4. LTD誘導プロトコール1
   1. 電流クランプ条件下でK⁺ベースの内部溶液を含む電極を使用して、1つのPF刺激と1つのCF刺激を同時に1Hzで5分間(300パルス)印加します(図1A)。
5. LTD誘導プロトコール2
   1. 電流クランプ条件下で電極を含むK ⁺ベースの内部溶液を使用して、2番目のPF刺激が1Hzで5分間CF刺激と一致するため、二重PF刺激(ISI50ミリ秒)と単一CF刺激を適用します(図1B)。
6. LTD誘導プロトコール3
   1. 電圧クランプ条件下でCs⁺ベースの内部溶液を含む電極を使用して、二重のPF刺激(ISIは50ms)と単一の脱分極電圧ステップ(-70〜0mV、50ms)を1Hzで体細胞に3分間印加し、2回目のPF刺激が脱分極電圧ステップの開始と同等になるようにします(図1C)。
7. LTD誘導プロトコール-4
   1. 電圧クランプ条件下でCs⁺ベースの内部溶液を含む電極を使用して、PF刺激(100Hzで5倍)と単一の脱分極電圧ステップ(-70〜0mV、50ms)を0.5Hzで体細胞に3分間同時に印加します(図1D)。

結果

図1:PF-PCシナプスでLTDを誘導するプロトコルの概略図。(A)プロトコル1 Cj.1 PFと1 CFの刺激は、電流クランプ条件下で1Hz(5分)で300回同時に印加されます。全細胞記録用電極には、K⁺ベースの内部溶液が含まれています。(B)プロトコル2 Cj.2 PFと1 CFの刺激は、電流クランプ条件下で1Hz(5分)で300回同時に印加されます。電極にはK⁺ベースの内部溶液が含まれています。(C)プロトコル3 Cj.2 PFと体細胞脱分極(-70〜0mV、50ms)を1Hz(3分)で180回、電圧クランプ条件下で適用し、2回目のPF刺激が体細胞脱分極の開始と同時に適用されるようにします。電極にはCs⁺ベースの内部溶液が含...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アンプ	分子デバイス-軸索	マルチクランプ 700B
ホウケイ酸ガラスキャピラリー	サッター	BF150-110-10
デジタイザー	分子デバイス-軸索	デジデータ1322A
電極プーラー	サッター	モデルP-97
イソフルラン	富士フイルム和光ピュアケミカル	26675-46-7
アイソレーター	A.M.P.I.	ISOフレックス
リニアスライサー	道坂EM	プロ7N
マイクロスコープ	ニコン	エクリプス E600FN
蠕動ポンプ	ギルソン	MP1シングルチャンネルポンプ
ピクロトキシン	シグマ・アルドリッチ	P1675
純水製造機	メルク・ミリポア	ミリQ 7000
実験用ソフトウェア	分子プローブ-軸索	pクランプ 10
統計用ソフトウェア	キエンスラボ	KyPlot 5.0
スティミュレーター	WPI	DS8000
温度コントローラー	ワーナー	TC-324B
テトロドトキシン	トクリス	1078