血液脳関門の病原体交差と脳細胞感染を研究するためのin vitroモデル

要約

出典:da Costa, A., et al. 病原体や医薬品によるバリアクロッシングと脳との相互作用を研究するための人間の血液脳インターフェースモデル。J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、血液脳関門(BBB)を通過する病原体を研究するためのin vitroモデルを示しています。タイトジャンクションを発現する微小血管内皮細胞は上部チャンバーに内皮層を形成し、ニューロン、アストロサイト、ミクログリアは多孔質膜で区切られた下部チャンバーの脳実質を表しています。BBBモデルにおけるウイルス感染は、血液から脳に横断する病原体を模倣しています。神経向性ウイルスを導入すると、トランスサイトーシスを介してBBBを通過し、神経細胞に感染し、ウイルスの子孫を複製して放出し、神経浸潤の成功を示します。

プロトコル

1. BBB-Minibrain(血液脳関門-Minibrain)の構造と品質管理(図1)

1. BBB-Minibrain Polyester膜培養インサートデバイスのセットアップ(図1B)
   1. ヒト脳内皮細胞株(hCMEC/D3細胞)を12ウェルポリエステル膜培養インサートフィルターで内皮細胞培地で6日間増殖させてから、実験に使用します。
   2. 12ウェルプレートにポリ-D-リジン(1 mL/ウェル、10 μg/mL、室温で4時間)をコーティングし、次にラミニン(1 mL/ウェル、1 μg/mL、室温で一晩)をコーティングします。
   3. ラミニンを除去し、5%ウシ胎児血清(FBS)(5%内皮細胞培地)を添加した内皮細胞培地1mLを加えます。
   4. 37°C、5%CO₂、湿度95%で1時間インキュベートします。
   5. 有糸分裂後のヒトニューロン(hNeurons)とヒトアストロサイト(hAstrocytes)(NT2-N/A)およびヒトミクログリア細胞株(CHME/Cl5)を穏やかにトリプシンし、細胞ペレットを完全な内皮細胞培地で解離します。
   6. 細胞を数え、3.6 x 10⁵ NT2-N/Aと0.4 x 10⁵ CHME/Cl5細胞/ウェルを混合し、12ウェルプレートを播種します。
   7. T = 24時間後(播種後24時間):使用した培地を新鮮な完全内皮細胞培地(Minibrain細胞および内皮細胞)と交換し、hCMEC / D3ポリエステル膜培養インサートフィルターをMinibrain細胞の上部に移します。BBB-Minibrainを37°C、5%CO₂、湿度95%でインキュベートします。
      注: BBB-Minibrain は、管腔コンパートメント (または「血液」コンパートメント) を分離するフィルター上のヒト内皮細胞 hCMEC/D3 の層と、管腔コンパートメント (または「脳」コンパートメント) を定義するウェルの底にあるヒト細胞 hNT2-N/A と hCHME/Cl5 (Minibrain) の混合培養物で構成されます (図 1B )。
2. BBB-Minibrainの内皮透過性の検証(品質管理)(図1C)
   1. Ca²⁺およびMg²⁺ を含むHBSS(Hanks'Balanced Salt Solution)バッファーであるトランスポートバッファー(TB)を調製し、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)および1 mMピルビン酸ナトリウムを添加します。
   2. ウェルあたり1.5 mLの輸送バッファーを含む12ウェルプレートを調製します。
   3. T = 0で、50 μM Lucifer Yellow(LY-TB)を補充した新しい輸送バッファーを作成します。
   4. 各フィルターを逆さまにして、内皮細胞バリアに影響を与えずに培地を慎重に取り出します。
   5. 充填した12ウェルプレートにフィルターを置き、0.5 mLのLY-TBを加えます。
   6. プレートをインキュベーター内で37°C、5%CO₂、湿度95%でインキュベートします。
   7. T = 10分で、新しいTB充填12ウェルプレートにフィルターを移し、OD読み取りのために最初のプレートのアブルミナルコンパートメントを保持します。
   8. T= 25 分で、ステップ 1.2.7 を繰り返します。
   9. T = 45分で、プレートからフィルターを取り外して輸送を停止します。OD対策のために、管腔と管腔のコンパートメントを保管してください。
   10. 暗い96ウェルプレートでサンプルを移します:LY-TBおよび管腔コンパートメント用の190μL TBで10μL、管腔コンパートメント用のサンプル200μL。
   11. λ428 nm、λ535 nm(それぞれ励起長波と発光長波)で、さまざまなサンプルに存在するLY-TBの蛍光を測定します。
   12. LY-TBに対する内皮透過性(Pe)(Pe_LY)を次の式で計算します:
       1/PSe= (1/PSt) – (1/PSf) および Pe_LY= PSe/S.
       注: PSfは細胞を含まないフィルターの透過性、PStは細胞を含むフィルターの透過性、PSeは単層の表面を時間内皮単層の透過性、Sは単層の表面(12ウェルフィルター= 1.12 cm²の場合)、Pe_LYはcm / minで表されます。hCMEC/D3の場合、Pe_LYは、主に実験で使用したFBSに応じて、0.7〜1.2 x 10^-3 cm/minの間である必要があります。重要: Pe_LY が 1.2 より大きい場合は、BBB が十分に締まっていないため、ある程度の漏れが観察される可能性があることを意味します。これらの障壁を捨てます。

2. 黄熱病ウイルスワクチンサンプル、フランスの神経向性ウイルス、YFV-FNV 34(図2)

に神経侵襲性ウイルス粒子の存在を強調するためのBBB-Minibrainの使用

1. Minibrainにおける黄熱病ウイルスのBBB交差と増殖
   1. ステップ1.1.7で説明されているように調製したBBB-Minibrainを、ウイルスの添加の24時間前に使用します。培地を2%FBS内皮細胞培地と交換します。
      注: ウイルスを追加する直前に培地を変更しないようにすることが非常に重要です。培地を変えると、ヒト内皮細胞が活性化され、ウイルスの通過を可能にするバリアが一時的に開きます。ここでは、実験開始の24時間前に培地を交換します。
   2. T = 0で、50μLの2%FBS内皮細胞培地で希釈したYFV-FNVの3500プラーク形成単位(PFU)を管腔コンパートメントの上部に非常に注意深く追加します。コントロールBBB-Minibrainに、ウイルスを含まない50μLの2%FBS内皮細胞培地を接種します。コンパニオンウェルでPe_LYを決定します。
   3. BBB-Minibrainをインキュベーター内で37°C、5%CO₂、湿度95%でインキュベートします。
   4. 24時間後、ポリエステル膜培養インサートフィルターデバイスを取り外し、Pe_LYを測定し、管腔コンパートメントから1mLをサンプル化し、ウイルスを滴定します。培地を新鮮な2%FBS内皮細胞培地と交換します。
   5. BBB-Minibrainを37°C、5%CO₂、湿度95%でインキュベートします。
   6. 72時間後、管腔コンパートメントから培地をサンプリングし、ウイルスを滴定し、および/または遺伝子発現分析のためにMinibrain細胞からRNAを抽出します。

結果

図1:BBB-Minibrainモデル。A. hCMEC/D3培養のタイムスケジュールとBBB-Minibrainデバイスの写真:hCMEC/D3内皮バリアを備えたポリエステル膜培養インサートフィルターを鉗子で保持してから、12ウェルの細胞培養プレートの1ウェルに挿入します。B.内皮細胞バリアを含む管腔(血液)コンパートメントとMinibrain細胞(ヒトニューロン、星状細胞、ミクログリア細胞)を含むアブルミナル(Brain)コンパートメントを備えたデバイスを説明する漫画。C. 3つのデバイス上のTEERによるBBB-Minibrain透過性の代表的な測定(すなわち、経内皮電気抵抗)、または5つのフィルター上のLY(すなわち、PeLY)への透過性。D. 内皮細胞hCMEC/D3上の受容体、排出ト...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12ウェルプレート	コーニング	3336
85mmペトリ皿	ザルシュテット	83-3902-500
CHME/CL5	Unité de Neuroimmunologie Virale	ラフォン博士への要求に応じて
CMCの	カルバイオケム	217274
ダーク96ウェルプレート	コーニング	3915
DMEM F12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31330-038
DMSOの	メルクシグマアルドリッチ	D2650
エンドグロIV	ミリポア	SCME004
エタノール	カルロ・エルバ	529121
FBSの	ハイクロン	SV30015-04	内皮細胞培地
Ca2+-MG2+ の HBSS	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14025から100
hCMEC/D3	シダーレーン	CLU512
ヘペス1M	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630-070
ラミニン	メルクシグマアルドリッチ	L6274
L-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒25030-024
ルシファーイエロー	メルクシグマアルドリッチ	L0259
MEM 10倍	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21430
MEM 1X	サーモフィッシャーサイエンティフィック	42360
NTERA/Cl2D.1	ATCCの	CRL-1973
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡科学	15714
CaなしのPBS2+-Mg2+	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190
PBS-CA2+-MG2+	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14040-091
ペン/連鎖球菌	ユーロビオ	CXXPES00-07
ポリ-d-リジン	メルクシグマアルドリッチ	P1149
ゴールドを延長する	サーモフィッシャーサイエンティフィック	P36930
RNA精製キット	キアゲン	74104
重炭酸ナトリウム 5.6%	ユーロビオ	CXXBIC00-07
ピルビン酸ナトリウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11360
T75 セル+ フラスコ	ザルシュテット	83-1813-302	特定の表面処理を施した組織培養ポリスチレンフラスコ(Cell+)は、敏感な接着細胞のためのものです
トランズウェル	コーニング	3460	ポリエステル多孔質膜培養インサート
トリプシン-EDTA	メルクシグマアルドリッチ	T3924
超純水	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10977-035
ヴェルセーネ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15040-033	EDTAの
YFV-FNVの	IPダカール	ワクチンバイアル

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