グリア細胞のシングルセルイメージングのためのショウジョウバエ脳の免疫蛍光染色

要約

出典:Batelli, S., et al.MultiColor FlpOut 技術の応用による、ショウジョウバエ におけるグリアの高解像度単一細胞形態と細胞相互作用の研究。 J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、グリア細胞のシングルセルイメージングのためのトランスジェニックショウジョウバエ脳の免疫蛍光染色を実演しています。脳は、グリア特異的な組換え酵素システムの制御下で、抗原性エピトープのさまざまな組み合わせと融合した膜標的タンパク質を発現します。単離および固定された脳は、抗原エピトープに特異的な一次抗体で染色され、続いて蛍光色素標識二次抗体で染色されます。この標識により、さまざまな脳領域にわたる異なるグリア細胞亜集団の同時イメージングが可能になります。

プロトコル

1. マルチカラーFlpOut(MCFO)実験用のハエの準備

注:MCFO技術は、いわゆるFlp-mediated Stop Cassette Exision(FlpOut)の修正版を指します。トランスジェニックMCFOフライは、ヒートショックプロモーター(hsp)-Flpリコンビナーゼとアップストリーム活性化配列(UAS)制御下で異なるレポーターを運びます。各レポーターは、エピトープタグ(HA、FLAG、V5など)が10個挿入されたミリストイル化(myr)スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質(sfGFP)の共通のバックボーンで構成されています。得られた非蛍光タンパク質は「スパゲッティモンスターGFP」(smGFP)と名付けられ、さまざまなエピトープタグに対する特異的抗体を使用して検出できます。

1. MCFOカセットとhsp-Flp(hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5)を使用して、適切なグリアGAL4ドライバーライン(材料の表を参照)にクロスフライします。
   1. hspは25°Cですでに活性があり、組換えを受けて非特異的な標識につながる細胞はほとんどないため、システムの漏れを避けるために18°Cでクロスを設定します。F1世代を入手するには、18°Cで約20日待ちます。ヒートショック後(ステップ2を参照)、フライを25°Cに保ちます(図1)。

2. ヒートショック

注:挿入部位によっては、hsp-Flpの効率が異なる場合があるため、最適な熱衝撃時間を最適化する必要があります。このプロトコールでは、hsp-FlpがX染色体に挿入されたMCFOフライストックが使用されています(材料の表を参照)。

1. ステップ1.1(F1世代ハエ、3〜4日齢)で交配の子孫を食物が入った新しいバイアルに移し、水浴中で37°Cでそれらを熱ショックします
   手記：若いハエ(生後1〜2日)は、熱ショックに非常に敏感です。治療による死亡率を減らすために、ヒートショックを行う前にさらに1〜2日待ってください。F1世代のフライの一部をコントロールとして使用し、ヒートショックを受けさせません。
2. ヒートショックの間は、ストレスによる死亡率を減らすために、ハエを通常のバイアルに餌と一緒に入れたままにしてください。女性と男性を別々のバイアルに入れます。
3. 均質な熱ショックを確保するために、バイアル全体を水に浸してください。多くのGAL4ドライバーラインを持つグリア細胞のスパース標識の適切な開始点として、5〜8分のショックを使用してください。衝撃時間は、ドライバーと実験ごとに最適化する必要があります(熱衝撃時間が短くなったり、長くなったりする必要がある場合があります)。
4. ヒートショックの後、ハエがヒートショックから回復するまで、バイアルをベンチに数分間水平に置きます
   手記：バイアルを交換する必要はありません。
5. フライを25°Cに維持し、熱ショックの2日以上後にフライを解剖(ステップ3および4を参照)して、最適なレポーター発現を実現します。

3. 解剖の準備と解決策

1. 解剖当日は、180 μL の S2 細胞培養培地と 20 μL の 20% パラホルムアルデヒド (PFA) を混合して、200 μL PCR チューブに新鮮な固定液を調製し、2% PFA 溶液を得ます。解剖前および解剖中に固定液を氷上に維持します.
   注意：PFAは有毒であり、注意して取り扱わなければなりません.
   手記：160 μLのS2細胞培養培地と40 μLの20%パラホルムアルデヒド(PFA)を200 μLのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブに混合して、2%溶液ではなく4% PFA溶液を調製します。
2. 遺伝子型ごとに1本のPCRチューブを使用し、チューブあたり最大8〜10個の脳を使用して、最適な染色結果を得ることができます。
3. 成人の洗脳液を準備します:0.5%ウシ血清アルブミン、0.5%トリトンX-100リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS).
   注:染色によっては、1% Triton X-100を含む溶液が必要になる場合があります。Triton X-100の濃度が高いと、抗体の組織への浸透が増加するため、組織の深部にある領域(成体のショウジョウバエの脳のシナプス領域など)を染色する必要があります。
4. ブロッキング溶液を調製します:3%正常ヤギ血清、3%標準ロバ血清、および0.5%トリトンX-100PBS溶液。
5. 成人用洗脳液とブロッキング液は、4°Cで数週間保存できます。
6. 深いくぼみ井戸ガラス板を氷の上に置き、各井戸に70%エタノール、PBSを含む1つ、S2細胞培養培地を含む溶液で満たします。

4. 成人の脳の解剖

1. 実体顕微鏡のステージ上に3cmの解剖皿を置き、冷たいS2細胞培養培地で満たします。この培地ですべての解剖を行い、解剖手順中に組織が健康に保たれるようにします。
   手記：数ミリメートルの黒いシリコンで裏打ちされた解剖皿を使用して、背景のコントラストを良好にし(画像内)、解剖中に鉗子を保持します。
2. 目的の遺伝子型のハエをCO₂で麻酔します。
3. 鉗子を使用して、フライの翼をつかみ、冷たい70%エタノールで30秒間洗浄し、次に冷たいPBSでさらに30秒間洗浄します。
4. フライをS2細胞培養培地で満たされた深いくぼみウェルに移します。
5. 同じ遺伝子型のすべてのハエに対して同じ手順を繰り返し、組織を保存する解剖まで冷たいS2細胞培養培地でそれらを維持します。
   手記：約30分間に解剖できるハエの数だけを麻酔します。S2細胞培養培地でのインキュベーション時間が長いと、組織が損傷する可能性があります。
6. 鉗子でフライをつかみ、実体顕微鏡でフライをS2細胞培養培地に浸します。
7. 頭を体の他の部分から取り外します。体を捨て、頭部をS2細胞培養液に浸しておきます。解剖の全期間にわたって鉗子で頭を保持することが非常に重要です。頭が浮き始めると、組織を傷つけずに頭を取り戻すのが難しくなります。
8. 解剖は、常に少なくとも1つの鉗子で頭を保持しながら、片方の目を引き出します。鉗子の先端が網膜のすぐ下にあることを確認して、下の組織を傷つけないようにしてください。もう一方の目を引き出し、脳が現れるまでキューティクルの除去を開始します。
9. 脳の周りのすべての気管組織とキューティクルを、組織がきれいに見えるまで取り除きます。最適な染色結果を得るために、脳の周りのすべての気管組織を必ず除去してください。これで、組織を固定して染色する準備が整いました。
10. 解剖したすべての脳をPFA溶液に移す前に、低温のS2細胞培養培地に保持して、固定ステップのタイミングを計ります。

5. 成人の脳染色

1. P10ピペットで単離した脳を室温(RT)のPFA溶液に移します。組織の損傷を避けるために、解剖後に脳を移植するために鉗子を使用しないでください。すべてのステップを200 μL PCRチューブのニューテーターで実行します。
2. すべてのステップで、P200ピペットで古い溶液を廃棄する前に、脳がチューブの底に落ち着くのを待ちます。組織を吸引せずに上清を除去してみてください。光にさらされないように組織を保護します。
3. S2細胞培養培地中の200 μLの2% PFAに1時間、または4% PFAに30分間脳を固定します。再現性を高めるために、サンプル間で固定時間を同じに保ちます。
4. 成人の洗脳液200μLで各15分を3回(またはそれ以上)洗浄した後、200μLのブロッキング溶液で組織を30分間ブロックします。ブロッキング溶液中でのインキュベーション時間が長くなる可能性があります。
5. 一次抗体を成人の洗脳液で希釈した一次抗体を総容量200 μLにして、脳を4°Cで一晩インキュベートします。
   手記：インキュベーション時間は、使用する抗体の種類によって異なる場合があります。より長いインキュベーションが必要になる場合があります。
   1. 3つのMCFOマーカーを標識するために、抗HA(1:500)、抗FLAG(DYKDDDDKエピトープ)(1:100)、および抗V5一次抗体で脳をインキュベー
   トします。
   2. 通常の一次抗体+二次抗体の代わりに、一次直接標識抗体を使用することができます(例:抗V5:DyLight 549(1:200))。この場合、直接標識抗体を二次抗体として扱います.
      手記：各遺伝子型について、染色の特異性を確認するためのコントロールとしていくつかの脳を保持します。一次抗体のインキュベーションをスキップして、次のステップに直接進んでください。
6. 成人の脳洗浄液200μLで組織を1時間3回洗浄し(ステップ3.3)、成人の脳洗浄液で希釈した二次蛍光色素複合体/一次直接標識抗体と4°Cで一晩または室温で4時間、総容量200μL
   でインキュベートします 手記：適切な抗体の例:AlexaFluor 488(1:250)、抗V5:DyLight 549(1:200)、DyLight 647(1:100)標識抗体。
7. 成人の脳洗浄液200μLで1時間、脳を3回洗浄し、続いてPBSの200μLで4°Cで一晩、またはRTで1-2時間の最終洗浄を行います。PBSでの最終洗浄ステップは、Triton X-100の痕跡を除去し、最適な染色結果を得るために必要です。ブレインを封入剤に封入剤に封入し、ガラスカバースリップに色あせ防止剤を塗布します。

6. イメージング用ブレインの取り付け

1. はさみを使用してイメージングスペーサーを適切なサイズにトリミングします。高解像度顕微鏡法の場合は、試料とイメージングスペーサーを2つのガラスカバースリップで挟みます.
   手記：イメージングスペーサーは、薄い(厚さ0.12mm)接着性スペーサーで、ガラスのカバースリップや顕微鏡スライドに剥がれてくっつくため、圧縮せずに試料を取り付けることができます。
2. 鉗子を使用して、接着ライナーを一方の表面から取り外し、ガラスカバースリップ(22 mm x 60 mm)の表面にスペーサーを接着剤面を下にして塗布します。10 μLの封入剤を新しいガラスカバースリップに塗布します。
3. P10ピペットを使用して、200 μLチューブから封入剤の滴の隣にあるカバースリップに脳を移します。組織と一緒に、脳を溶液中に維持するために、一部のPBSを移します。
4. P10ピペットを使用して、脳をPBSから封入剤の滴下に移し、PBSの量を制限します。標本を封入剤に入れ、イメージングスペーサーを使用してカバースリップに移します。試料を覆うのに十分な封入剤を使用してください。
5. スペーサーの上側からもう一方の接着ライナーを取り外し、試験片の上にガラスカバースリップを追加します。鉗子の先端で、接着部にやさしく圧力をかけてシールします。マウントされた組織をすぐに画像化するか、スライドを-20°Cで保存して後で分析します。

結果

図1:MCFO技術のクロッシングスキーム。 MCFO技術の概略図。MCFOカセットとhsp-Flp(hsp-Flp;10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5)を運ぶホモ接合体は、特定のホモ接合型GAL4ドライバーオスと交配されます。その後、F1世代はヒートショックを受けます。レポーターからランダムに取り外されたFRT-stop-FRTカセットの数に応じて、7つの異なる色が可能です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウォーターバス	叶える	GD100
PCRチューブ	ザルシュテット	72.737.002
鉗子	デュモン	11251から20
解剖皿 30 mm x 12 mmmm	電子顕微鏡科学	70543から30	ガラス解剖皿
パイレックス3うつ病ガラススポットプレート	コーニング	7223から34	ガラス解剖プレート
シルガードブラック	シルガード、シグマ・アルドリッチ	805998	木炭で作った家
ExpressFive S2細胞培養培地	インビトゲン	〒10486-025
PFA20%	電子顕微鏡科学	15713
トリトンX-100	ロス	3051.3
正常なヤギの血清	ジャクソン研究所	005-000-121
通常のロバ血清	ジャクソン研究所	017-000-121
ウシ血清アルブミン	シグマ	A9647
ウサギHAタグ	細胞シグナル伝達	C29F4	一次抗体、希釈率 1:500
ラットFLAG-タグ	ノーバスバイオロジカルズ	NBP1-06712	一次抗体、希釈率 1:100
マウスV5タグ:DyLight 549	アドセロテック	411	標識抗体、希釈率 1:200
抗ウサギ AlexaFluor 488	インビトゲン	A11034 (英語)	二次抗体、希釈率 1:250
ネズミ対策 DyLight 647	ジャクソン研究所	〒712-605-153	二次抗体、希釈 1:100
ベクタシールド	ベクターラボラトリーズ	H-1000
SlowFateゴールド	インビトゲン	S36937
セキュアシールスペーサー	グレースバイオラボ		注文については会社にお問い合わせください
顕微鏡カバーガラス22 X 60 mm	マリエンフェルド	101152
顕微鏡カバーガラス22 x 22 mm	ロス	H874
実体顕微鏡 ライカ MZ6	ライカ
共焦点レーザー走査型顕微鏡 LSM710	ツァイス
イメゾール	ツァイス	518ファックス	蛍光顕微鏡用浸漬油、ハロゲンフリー
イメゾール	ツァイス	W 2010	水浸対物レンズ用液浸液、ハロゲンフリー
R56F03-GAL4 (EG)	ブルーミントンストックセンター	39157	GAL4 ドライバー
R86E01-GAL4 (ALG)	ブルーミントンストックセンター	45914	GAL4 ドライバー
hspFlpPestOpt;UAS-FRT-ストップ-FRT-myr-smGFP-HA、UAS-FRT-ストップ-FRT-myr-smGFP-FLAG、UAS-FRT-ストップ-FRT-myr-smGFP-V5	ブルーミントンストックセンター	64085	UASレポーター (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
マルチタイムマクロ	ツァイス		自動スキャン用ソフトウェア

の (代表) の の 名 さん 年