遠心分離支援による神経膠芽腫幹細胞へのミトコンドリア移植

要約

出典:Mombo, B. N., et al. MitoCeption: transfer isolated human MSC mitochondria to glioblastoma stem cells. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオでは、蛍光標識されたミトコンドリアを遠心分離によって膠芽腫幹細胞(GSC)に移す方法が示されています。ドナーミトコンドリアの良好な取り込みと機能的統合は、共焦点顕微鏡を使用して蛍光を検出することによって確認されます。

プロトコル

1日目

1. 間葉系幹細胞(MSC)ミトコンドリアの標識

1. ミトコンドリア調製の2日前に、10 ml(Minimum Essential Medium Eagle)/ FBS(Fetal Bovine serum)10%の100 mmカルトオーレ皿にヒトMSCを播種し、1日目に4 x 10⁵ MSCを培養します。
2. MSCをPBS(4 ml)ですすぎ、4 mlのαMEM/FBS 1%(37°Cに予熱)を加えます。
3. 必要量のミトコンドリアバイタル色素を添加し、37°Cインキュベーターで細胞を30分間インキュベートします。
4. ミトコンドリア色素溶液を取り出し、予熱した4 mL(37 °C)αMEM/FBS 1%で細胞を2回すすぎ、4 mLのαMEM/FBS 10%を再び加えます。細胞を37°Cでインキュベートします。
5. 30分後に培地(10 mL αMEM/FBS 10%)を交換し、さらに2時間後に交換します。

1日目

2. 膠芽腫幹細胞(GSC)の標識

1. ポリHEMAコーティング細胞培養フラスコ上でニューロスフェアとして増殖したGSCs Gb4細胞株(10 x 10⁶細胞)の解離
2. 48ウェルプレートにGSCを10⁵細胞/ウェルでGSC増殖培地(500 μl)で播種します(表1を参照)。
3. プレートを270 x gで5分間、20°Cで遠心分離します。
4. 必要な量のCell Vital Dyeを添加し、37°Cで30分間インキュベー
トします。
5. 48ウェルプレートのウェルあたり500 μlのGSC基礎培地(表1)を添加します。
6. プレートを270 x g、20°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
7. 手順2.5から2.6を繰り返します。
8. 500 μlのGSC基礎培地を加え、37°Cで30分間インキュベートします。
9. プレートを270 x g、20°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
10. 48ウェルプレートのウェルあたり500 μlのGSC増殖培地を加え、37 °Cインキュベーターでインキュベートします><。 手記：示されたGSCの量(10 x 10⁶細胞)により、異なる用量反応実験およびFACSコントロールを実施することができます。実験条件がより正確に定義されると、この量を縮小できます。

3. 膠芽腫幹細胞の播種

1. GSC(膠芽腫幹細胞)ニューロスフェア(10 x 10⁶細胞)を、270 x gで5分間、50 mLチューブ内で20°C遠心分離して収集します。
2. 細胞を5 mlのHBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)で洗浄し、270 x gで20°Cで5分間遠心分離します。
3. 上清を吸引します。
4. GSCペレットを100 μlのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸) (0.25%) (10 x^{10 6}細胞あたり) に穏やかに再懸濁します。
5. 37°Cで3分間インキュベートします。
6. 10 μl CaCl₂ (20 mM) と 2 μl DNase I (10 mg/mL) を添加します。
7. P200ピペットで静かに上下(30〜50倍)して、ニューロスフェアを解離します。泡を避けてください。顕微鏡ですべてのGSCが解離していることを確認します。
8. トリプシン阻害剤10μl(5%)とHBSS10mlを添加します。
9. GSCを270 x gで7分間、20°Cで遠心分離します。
10. 上清を捨て、10mlのGSC基礎培地を加えます。
11. Thoma計数チャンバーでGSCをカウントし、細胞を270 x gで20°Cで7分間遠心分離します。
12. 適切な量のGSC増殖培地を添加して、細胞濃度が10⁶ GSCs/mlになるようにします。
13. 96ウェルプレートのウェルあたり10⁵ GSC(細胞懸濁液100 μl)をシードします。
14. プレートを270 x gで7分間、20°Cで遠心分離し、ウェルの底にGSCを留まらせます。
15. 96ウェルプレートを37°Cでインキュベートします。

2日目

4. MSC(間葉系幹細胞)ミトコンドリア単離

1. マイクロチューブ遠心分離機の温度を4°Cに調整します。
2. ミトコンドリア抽出用の試薬を含む2本の1.5 mLチューブ「A」と「C」を準備します(200 μlの試薬Aと400 μlの試薬C、どちらもEDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤を含む)。「MSC」と「Mito」とラベル付けされた他の2つのチューブを準備します。すべてのチューブを氷の上に保ちます。また、ミトコンドリアの段階希釈用のチューブを準備します。
3. MSCは、10 mLの予熱済み(37 °C)PBS(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄します。
4. MSCを2 mlのトリプシン(EDTAなし)で10秒間洗浄し、1 mlのトリプシン(EDTAなし)を追加します。.細胞を37°Cで5〜10分間インキュベートします。
5. 10 mLのαMEM / FBS 10%を50 mLチューブに移してMSCを回収します。
6. 細胞を270 x gで5分間、20°Cで遠心分離します。
7. 上清を捨て、10 mLのαMEM/FBS 10%を細胞ペレットに加えます。
8. マラセスカウントチャンバーでMSCをカウントします。
9. MSC(4-5 x 10⁵)を270 x gで5分間、20°Cで遠心分離します。
10. 上清を捨て、1 mの氷冷αMEM/FBS 10%を細胞ペレットに加え、細胞をMSC標識チューブに移します。チューブを氷の上に保ちます。
11. MSCを含むチューブを900 x gで5分間、4°Cで遠心分離します。
12. チューブからすべての残留媒体を取り除きます。
13. 200 μlのミトコンドリア単離試薬A(EDTAフリープロテアーゼ阻害剤を含む)を加えます。中速で5秒間渦巻き、チューブを氷の上に正確に2分間放置します。
14. 2.5 μlのミトコンドリア単離試薬B.ボルテックスを最高速度で10秒間加え、チューブを氷上に置きます。30秒ごとに5分間繰り返します。
15. 200 μlのミトコンドリア単離試薬C(EDTAフリープロテアーゼ阻害剤を含む)を加えます。チューブを傾けて混合します(約30倍、渦巻きにしないでください)。チューブを700 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
16. 上清(MSCミトコンドリアを含む)を「水戸」チューブに移します。
17. 3,000 x g、4°Cで15分間遠心分離し、ミトコンドリアペレットを得ます。上清を捨てます。ペレットには単離されたミトコンドリアが含まれています。
18. ミトコンドリアペレットを200 μlの試薬Cですすいでください。次に、12,000 x gで4°Cで5分間遠心分離し、ミトコンドリアペレットを得ます。

5. 単離されたMSCミトコンドリアのGSCsへの転写(MitoCeption)

1. 予冷したGSC増殖培地200 μlを、MSCから単離したミトコンドリアペレット(4 x 10⁵)に加えます。
2. ミトコンドリア調製物(GSC増殖培地)を希釈して、20 μlのミトコンドリア懸濁液をGSCに一貫して加えます。
3. 単離されたミトコンドリアの量を、GSCを含む96ウェルプレートのウェルに、所望の濃度(0.1〜10μg)で加えます。ミトコンドリアをゆっくりと、ウェルの底の近くに追加し、少なくとも一度は表面全体を覆います。
4. ミトコンドリアレシピエントGSCを含む96ウェルプレートをMSCミトコンドリアとコントロールプレートで1,500 x g、4°Cで15分間遠心分離します。
5. 遠心分離後すぐに培養プレートを37°C細胞インキュベーターに入れます.
   手記： ミトコンドリア転写プロトコルは、ミトコンドリアドリアドナー/レシピエント細胞のシステムに応じて調整できる多数の遠心分離を使用して、適切な遠心分離力で培養細胞上のミトコンドリア懸濁液を遠心分離することに依存しています。

表1:培養培地。

細胞培養培地	組成
GSC基礎媒体	DMEM/F-12 を補完
	インスリン20 mg / ml
	N2サプリメント1x
	グルコース3 g / L
	L-グルタミン 2 mM
GSC増殖培地	基礎培地に加える:
	B27サプリメント1x
	EGF10 ng / ml
	bFGF 10 ng/ml
	菌類10 mg / ml
	菌類0.25 mg / ml
	ヘパリン 2mg /ml
	シプロフロキサシン2μg/ ml
	ゲンタマイシン 2 μg/ml
MSC増殖培地	αMEMを添加
	L-グルタミン 2 mM
	10%FBSの
	bFGF 2 ng/ml

結果

図1:MitoCeptionによる単離されたMSCミトコンドリアのGSCへの転写のワークフロー。 MSCミトコンドリアのGSCへのMitoCeptionの7つのステップとその後のGSC分析が示されています。ステップ番号は、プロトコルのセクションに示されているように示されています。MSCおよびGSC標識を行わない場合、機能解析と同様に、ステップ1および2を省略し、2日目からプロトコールに従うことができます。位相差画像は、Gb4 GSCをニューロスフェア(1日目)、MSCミトコンドリア移植の準備ができている単細胞培養(2日目)、およびミトコンドリア移植の24時間後(3日目)として表しています。スケールバー = 100 μm。ステップ4では、単離されたMSCミトコンドリアの代表的な顕微鏡写真で、MSCから単離する前にMitoTracker Red CMXRosで事前に標識しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
組織用ミトコンドリア単離キット	フィッシャーサイエンティフィック	10579663
N-2 サプリメント (100X)	フィッシャーサイエンティフィック	11520536
B-27 増補 W/O VIT A (50X)	フィッシャーサイエンティフィック	11500446
HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+	シグマ	H4385
ポリヘム	シグマ	P3932
aMEM w/o グルタミン	オザイム	BE12-169F
グルタミンなしのDMEM/F-12、	フィッシャーサイエンティフィック	11540566
L-グルタミン	インビトジェン	25030-024
グルコース	シグマ	G7021
インスリン	シグマ	I 1882
ヒトbFGF	R&Dシステムズ	233-FB-025
ヒトEGF	ペプロテック	AF-100-15
ヘパリン	シグマ	H3149
CaCl2	メルク	2382
トリプシン阻害剤	シグマ	T9003
DNase I	シグマ	10104159001
トリプシン 0.25% /EDTA 1 mM	インビトジェン	25200056
トリプシン	ギブコ	15090-046
プロテアーゼ阻害剤EDTAフリー	シグマ	4693159001
シプロフロキサシン	シグマ	17850-5G-F
ファンジン	インビボジェン	アント-FN-1
ファンジゾーン	サーモフィッシャー	15290018
ゲンタマイシン	ユーロメデックス	EU0410
MitoTracker グリーンFM	分子プローブ	M7514
MitoTracker レッドCMXRos	分子プローブ	M7512
MitoTracker ディープレッドFM	モレキュラープローブ	M22426
セルトラッカー グリーン CMFDA	分子プローブ	C7025
セルトラッカー ブルー CMF2HC	分子プローブ	C12881
リパ	サンタクルス	SC-24948
フルオロディッシュ 無菌培養皿	世界の精密機器	FD35-100
血球計算盤	フィッシャーサイエンティフィック	267110
FACSチューブ	ベックマン・コールター	25,23,749
FACS装置	ガリオス	3L 10C
LCファストスタート DNAマスタープラス	ロシュ	3515885001