さまざまな剛性のハイドロゲルで培養した神経堤細胞の蛍光染色

要約

出典: Le, T. P., et al., An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (2021)

この動画では、さまざまな硬さのハイドロゲルで培養した神経堤細胞のファロイジン染色を実証するために、蛍光顕微鏡を用いた蛍光染色を行う手順を説明し、細胞骨格の組織化を可視化・解析します。

プロトコル

1. 免疫蛍光染色によるこわばりの分子解析

1. ピンセットを使用してカバーガラスを新しいプレートに輸送し、プレート上に直接増殖した細胞からの誤ったシグナルを最小限に抑えます。細胞を500 μLの滅菌PBSで3回洗浄し、死んだ細胞と残っている培地を取り除きます。
2. 乱さずに500μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を室温で10分間使用して細胞を固定します。次に、500 μLのPBS/ウェルを使用して細胞を3回、各2分間再洗浄します。
   注:手続き上の停止のために4°Cで保存してください。
3. 細胞を500 μLの0.1% Triton X-100で室温で15分間処理します。次に、500 μLのPBS/ウェルで細胞を3回洗浄します。
4. ウェルあたり250 μLの10%ロバ血清(PBSおよび0.1% Tween 20で希釈)で細胞を室温で30分間ブロックします。
5. F-アクチン染色に用いるファロイジンと、10%ロバ血清250μL中1:400の希釈度で、室温で30分間細胞をインキュベートします。次に、細胞をPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
   注:568 nmのファロイジンは、488 nmまたは647 nmの二次抗体と共インキュベートすることも、単独でインキュベートすることもできます。
6. 細胞を4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI、1:1000希釈) と250 μLのPBSで10分間インキュベートし、続いて最後にPBSを2分間洗浄します。
7. 各ウェルに3〜4滴の封入剤を加えます。サンプルを4°Cで保存し、イメージング前に少なくとも2時間置いてから、封入剤が適切にセットされていることを確認してください。
8. 蛍光顕微鏡を使用して、ハイドロゲルサンプルごとに少なくとも3つのランダムフレームの画像をキャプチャし、個々のチャネルとマージされたチャネルを生成します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2 mm #1 Corning 0211 ガラスカバースリップ	ケムグラスライフサイエンス	CLS-1763-012
25 mm #1 Corning 0211 ガラスカバースリップ	ケムグラスライフサイエンス	CLS-1763-025
4ウェル細胞培養プレート	サーモサイエンティフィック	179830
4% パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	J61899-AP通信
アクリルアミド 40%	シグマ・アルドリッチ	A4058 (英語)
アレクサフルオア488ファロイジン	サーモフィッシャー	A12379 (英語)
I.型コラーゲン(100mg)	コーニング	354236
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)	サーモフィッシャー	D1306
ロバの美容液	シグマ・アルドリッチ	D9663
滅菌 1x PBS	ハイクロン	SH30256.02
蛍光顕微鏡	ライカ

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