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動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1. 作業溶液とバッファーの調製
注:アッセイの朝に、次の溶液を準備します。この計算は、12匹のマウスから得られた2つの脳領域(すなわち、前頭前野[PFC]と海馬[HPC])を処理するために必要な解に基づいています。
- 表1に記載されているように、人工脳脊髄液(aCSF、pH = 7.4)を調製します。750 μL の aCSF を各サンプリングチューブに分注し、氷上の金属温度ブロックに入れてバッファーを予冷します。
- 表2に示すように、溶解バッファーを調製します。氷上に保存します(サンプルごとに400μLを使用します)。
- 5 mM クエン酸ナトリウム緩衝液 (pH = 5.0) に 52 mM ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートまたは BS3 ストック溶液 (26x) を調製します。
- まず、100 mM のクエン酸(ストック A)と 100 mM のクエン酸ナトリウム(ストック B)を調製します。
- ストックAとストックBを脱イオン水で1:20の比率で希釈します。1.9 mLの水にそれぞれ100 μLを加えて、5 mMのクエン酸(ストックC)と5 mMのクエン酸ナトリウム(ストックD)をそれぞれ調製します。
- 410 μLのストックCと590 μLのストックDを混合して、5 mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH = 5.0)(溶液E、1 mL)を調製します。
- pH指示薬ストリップを使用して溶液EのpHを確認します。
- 24 mg の BS3 を 806.4 μL の溶液 E に 30 秒間ボルテックスして溶解し、BS3 ストック溶液 (26x) を調製します。
- 非架橋サンプルのビヒクルコントロールとして使用するために、さらに 1 mL の溶液 E を調製します
注:他のすべての準備ができ、実験が始まろうとしているときに、BS3ストック溶液を準備します。BS3は、使用するまで4°Cで乾燥させて保管する必要があります。一度再構成すると、BS3は約≤3時間しか活性を保ちません。5 mM クエン酸ナトリウム緩衝液(溶液 E)の pH は時間の経過とともに上昇し、BS3 加水分解が加速すると報告されているため、溶液 E はストック溶液 A および B から新鮮に調製することをお勧めします。BS3 の低温での溶解度が限られているため、再構成した BS3 は室温に保つ必要があります。再構成した BS3 を 3 時間以内に使用してください。 また、再構成したBS3を凍結/解凍したり、再利用したりしないでください。
2. 脳組織の解剖
注:このステップから、少なくとも2人が協調して協力する必要があります。1人が動物の解剖に焦点を当てている間、もう1人はタイムキーパーとして働き、アッセイの調整を支援する必要があります。
- 解剖する最初の動物を住宅エリアから解剖室に持って行きます.
注:急性ストレッサー(例:新しい環境、血液の臭い)が脳タンパク質のダイナミクスに影響を与える可能性があるため、動物は解剖領域から遠く離れた自宅のケージに保管し、その後、すぐに斬首するために個別に解剖室に連れて行く必要があります。
- 子宮頸部脱臼とそれに続く斬首によってマウスを安楽死させます。頭蓋骨から脳を急速に取り出し、ペトリ皿の氷冷PBSに10〜15秒間沈めます(図1).
注:麻酔薬は神経伝達物質受容体の表面提示レベルに影響を与える可能性があるため、BS3実験では動物に麻酔をかけません。
- 冷やした脳を氷上の脳マトリックスに置き、脳の腹側を上に向けて置きます(図2)。
- 最初のカミソリの刃を嗅球と嗅球の境界に挿入して、脳を冠状に切断します(図3)。追加の3〜4枚のカミソリの刃を使用して、脳の前部を1mm間隔で冠状に連続して切断します。
- 挿入されたすべてのカミソリの刃を一緒に保持して、脳の鎖状から冠状スライスを持ち上げ、脳の後部を脳のマトリックスに残します。鉗子を使用してかみそりの刃を互いに分離し、脳のスライスを上に向けて平らで冷やした表面に置きます(図4)。
- 関心領域を含むスライスを特定します。PFCをサンプリングするには、嗅花柄を含む最初のスライスの後方にある2番目と3番目のスライスを選択します。
- ティッシュパンチを使用して関心領域を取り出し、冷やしたカミソリの刃の上で脇に置き、組織を均等に2つに分割します(例えば、左半球と右半球の組織で、目的の標的タンパク質が両方の半球で等しく発現している場合、半分をBS3架橋反応に使用し、もう半分を非架橋制御に使用します)。
- 組織をつぶしたり磨いたりする代わりに、鉗子の細い先端を使用して、ブレードに対して複数の垂直運動をしながら、かみそりの刃で各組織を細かく刻みます。これにより、細胞の膜完全性を著しく損なうことなく、BS3がアクセス可能な表面積が最大化されます。ミンチの直後に、ミンチした組織を適切なチューブに移します(ステップ3.3を参照)。
3. 架橋反応
- 前のマウスの脳の解剖が終了するところで、ハウジングエリアから解剖室に解剖する次の動物を連れて行きます(ステップ2.10)。
- 氷上で予冷したチューブに、30 μL の BS3 溶液 (26x) またはビヒクル溶液 E をスパイクします。これは、ミンチ組織を適切なチューブに移す準備が整う直前です。チューブ間のピペットチップを交換して、架橋なしコントロールチューブにBS3が汚染されていないことを確認します。
- 細かく刻んだ組織(ステップ2.8から)を適切なチューブに移し、次に次の動物の解剖を開始します(ステップ2.2)。
- チューブを反転させて混合し、組織の塊を細かく砕き、低温室のチューブローテーターでサンプルを30分から2時間インキュベートします。各チューブのBS3インキュベーションの開始時間を記録します。最適なインキュベーション時間については、ディスカッションセクションをご覧ください。
- チューブに78 μLの1 Mグリシンを添加して反応を急冷し、さらにサンプルを4°Cで10分間、一定の回転でインキュベートします。各チューブの焼入れ開始時刻と終了時刻を記録します。次の動物を連れてきて(ステップ3.1)、架橋を手伝う(ステップ3.2)ことで、動物の解剖に焦点を当てている人を継続的に支援します
注:各サンプルは、すべてのサンプルで同時に処理します。解剖室が冷蔵室から遠い場合は、冷蔵室でのサンプルインキュベーションと急冷に参加するために第三者を募集することを強くお勧めします。
表1:人工脳脊髄液の組成。
の
| ワーキングコンク。 | ストックソリューション | 分注するストック溶液の量 |
| 1.2 mM CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100μL |
| 20 mM HEPES | 1メートル(50倍) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 M (34倍速) | 1176.5μL |
| 2.7 mM KCl | 1.08メートル(400倍) | 100μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400倍速) | 100μL |
| 10 mM グルコース | 2.5メートル(250倍) | 160μL |
| 脱イオン水 | | 37.563ミリリットル |
| トータル | | 40ミリリットル |
| * CaCl2ストックは実験当日に新たに調製する必要があります。 |
表2:溶解バッファの構成
の場合
| ワーキングコンク。 | ストックソリューション | 分注するストック溶液の量 |
| 25 mM HEPES | 1 M (40倍) | 500μL |
| 500 mM NaCl | 5メートル(10倍) | 2ミリリットル |
| 2 mM EDTAの | 0.5 m (250x) | 80μL |
| 1 mM DTT | 1 M (1000x) | 20μL |
| NP-40 0.1% | 10%(100倍) | 200μL |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル | 100倍 | 200μL |
| 脱イオン水 | | 17ミリリットル |
| トータル | | 20ミリリットル |
