グルコース代謝がアップレギュレートされたショウジョウバエ幼虫の運動ニューロンにおけるグルコース取り込みの評価

要約

出典:Loganathan, S., et al., TDP-43タンパク質症のショウジョウバエモデルにおけるグルコース取り込みの測定.J. Vis. Exp. (2021年).

このビデオでは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ベースの細胞内グルコースセンサーを使用して、ショウジョウバエ幼虫の運動ニューロンにおけるグルコース取り込みを測定する技術を示しています。幼虫を解剖して腹側神経索を露出させた後、センサーのドナー蛍光色素分子が発する蛍光を通じて運動ニューロンを視覚化します。グルコースで刺激されると、センサーのドナーとアクセプター蛍光色素の間のFRETはアクセプターからの蛍光の放出をトリガーし、対照幼虫とグルコース代謝がアップレギュレートされた変異幼虫との間のグルコース取り込みの比較を可能にします。

プロトコル

1. ショウジョウバエ 腹側神経索(VNC)解剖

1. シリコーンエラストマー解剖皿を作ります。
   1. シリコーンエラストマー成分を、製造元のプロトコールに示されているように50mLのチューブに注ぎ、よく攪拌します。
   2. 35 mmの組織培養皿に約2 mLのエラストマー混合物を充填します。注射器を使用して気泡を取り除きます。皿に蓋をし、60°Cのオーブンで一晩硬化させる平らな面に置きます。
2. ショウジョウバエの幼虫を解剖し、組織の生存率を維持しながらVNCを露出させます。
   1. さまよう3番目の幼虫を採取し、ddH₂Oですすぎ、次にエラストマーで裏打ちされた皿にHemolymph-like 3 (HL3) buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM sosrose, 5 mM trehalose, 5 mM hydroxyethylpiperazine ethane sulfonic acid [HEPES]; pH 7.1) を一滴垂らします。
   2. 解剖顕微鏡下で一対の鉗子(#5または55鉗子)を使用して、幼虫の背側の前端と後端を上に固定し、昆虫ピン(Minutein Pins)で幼虫を縦方向に慎重に伸ばします。
   3. 角度のついた虹彩はさみを使用して、後ピンのすぐ上に切開を行います。切開部から幼虫の前端に向かって垂直に切り込みを入れます。
   4. 必要に応じて、HL-3バッファーを数滴追加します。中枢神経系(CNS)を乱すことなく、気管と残りの浮遊臓器を切除します。体壁を伸ばすフラップをピンで留めて、神経筋系(VNC、軸索、神経筋接合部)を無傷に保ちながらCNSを露出させます。

2. 画像取得

1. イメージングパラメータを最適化します。
   1. 解剖を開始する前に、顕微鏡とレーザーの電源を入れてください。画像は、40倍水浸レンズを備えた正立共焦点顕微鏡を使用して取得する必要があります。405 nmレーザーを使用してシアン蛍光タンパク質(CFP)を励起し、CFP(465-499 nm)とFRET(535-695 nm)の両方の検出チャネルで画像を取得します。
   2. スキャン速度(6)、平均(2)、対物レンズ(40倍)、ズーム(1倍)、ピンホールサイズ(1AU)、空間分解能(512 x 512)などの取得パラメータを最適化します。信号が最適なダイナミックレンジに入るようにゲインを調整します。すべての遺伝子型に同じパラメータを使用する必要があります。
2. VNC内の運動ニューロンを画像化します。
   1. 解剖したサンプルを入れたシリコンディッシュをレンズの下に置きます。レンズを下げて、トレハロース-スクロースHL3バッファーに接触させます。レンズがバッファに完全に沈んでいることを確認することが重要です。必要に応じて、バッファーを追加します。
   2. CFPチャンネルとFRETチャンネルを使用して、VNC正中線に沿って配置された、焦点が合っている少なくとも6つの運動ニューロンで構成される光学セクションを手動で選択します。運動ニューロンは、グルコースセンサーの発現と前後軸に沿った位置に基づいて識別されます。
   3. 10 秒ごとに 10 分間画像を取得します。これらの画像はベースラインを表しています。
3. HL-3を添加したグルコースで刺激します。
   1. パスツールピペットを使用してトレハローススクロース含有HL3バッファーを取り出し、5 mMグルコースを添加したHL-3(70 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM MgCl₂、10 mM NaHCO₃、115 mMスクロース、5 mMグルコース、5 mM HEPES、pH 7.1)と交換します。この手順は、VNCの動きをできるだけ避けるために、細心の注意を払って実行する必要があります。
   2. さらに 10 分間、10 秒ごとに画像を取得します。これらの画像は、刺激フェーズを表しています。
4. 画像を.cziファイルまたはイメージングソフトウェアでサポートされている任意のファイルタイプとして、日付、遺伝的背景、実験条件(ベースラインまたは刺激)、および使用したチャネルを含むファイル名で保存します。
5. パラメータを再利用して、すべての遺伝子型を画像化します(図1A)。

結果

図1:TDP-43変異体におけるグルコースセンサーの画像解析 (A) ベースラインおよび刺激条件下でのグルコースセンサーコントロールおよびTDP-43^G298SサンプルにおけるFRETおよびCFP信号の代表的な画像。代表的な運動ニューロンは、ROIの例として各画像で概説されています。スケールバー:20μm. 倍率:40倍 (B) 20分間のイメージングにおけるグルコースセンサーとTDP-43変異運動ニューロンにおけるFRET/CFPの平均比。比率は、各遺伝子型の平均ベースライン比に正規化されました(プロトコルのベースライン正規化を参照)。示されている値は、遺伝子型ごとに5つのVNCから25〜30の運動ニューロン(ROI)の平均です。Mann-Whitneyは、統計的有意性を評価するために使用されました。= ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
35 mm ティッシュカルチャーディッシュ	シグマ アルドリッチ	CLS430165
40倍水浸レンズ	ツァイス	440090	ディッパブル, N.A. 0.8
解剖ハサミ	ロボズ	RS-5618
デュモン #5 鉗子	VWR	100189-236
デュモン #55 鉗子	VWR	100189-244
ミニティエンピン	ファインサイエンスツール	26002-10	解剖に使用
SYLGARD 184 シリコーンエラストマーキット	ダウ	1317318
Zeiss LSM880 NLO 正立多光子/共焦点顕微鏡	ツァイス	該当なし