マウス脳組織切片における蛍光標識アストロサイトの免疫染色

要約

出典:Eaker, A. R., et al. 厚い浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの分析。J. Vis. Exp. (2022)

このビデオでは、一次抗体と二次抗体を使用して、蛍光標識されたアストロサイトによる固定マウス脳組織切片の免疫染色手順と、共焦点顕微鏡で染色されたアストロサイトの画像を取得する手順を示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 免疫染色

注:約100 rpmに設定された軌道プラットフォームシェーカーですべての洗浄とインキュベーションを実行します。一次抗体のインキュベーションは4°Cで実施されますが、すべてのステップは室温で行います。50 mLのチューブで成分を組み合わせ、ニューテーターで一晩混合することにより、事前に封入剤を調製してください。光から保護し、4°Cで最大2か月間保管してください。内因性蛍光シグナルが免疫染色を必要とせずにイメージングと分析に十分である場合、ステップ1.1-1.9をスキップできます。免疫染色をスキップする場合は、TBSで10分間の洗浄を3回行い、ステップ1.10に進みます。

1. 10% Triton-X 1 mL を 50 mL チューブに加え、チューブを 50 mL に 1x TBS で充填して、TBST の新鮮な溶液 (0.2% Triton in TBS) を調製します。各脳に対して 2 mL のブロッキング溶液と抗体溶液 (TBST 中の 10% ヤギ血清) を調製します。
   手記：最良の結果を得るには、新しい染色実験ごとに新しいTBSTを作成し、高品質の10%水溶液Triton-X(材料表)を使用してください。
2. 回路図に従って24ウェルプレートを標識します(図1)。異なるサンプルを異なる行に配置し、異なる溶液を異なる列に配置します。最初の 3 つのカラム (「Wash 1」、「Wash 2」、および 「Wash 3」)に TBST 1 mL を加えます。4 番目のカラムに 1 mL のブロッキング溶液を加えます。
3. ブンゼンバーナーを使用して5.75パスツールピペットの端を小さなフックに溶かして、ガラスピックを準備します。このピックを使用して、12ウェルプレートから組織切片を24ウェルプレートのWash 1カラムに移します><。 手記：最良の結果を得るには、染色を開始する前に切片をスクリーニングします。切片をスクリーニングするには、切片を1つずつ1x TBSで満たされたシャーレに移し、5倍または10倍の対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して切片を検査し、十分な数の蛍光標識細胞が存在することを確認します。ウェルごとに4〜6個のセクションを染色することをお勧めしますが、必要に応じてウェルごとに最大8個まで染色できます。
4. Wash 1、2、3ウェルで切片をそれぞれ10分間洗浄し、その後、ブロッキング溶液中で1時間インキュベートします。ガラスピックを使用して、セクションを1つのウェルから次のウェルに移します。このピックは、一度に複数の脳の切片を移すために使用することができます。
5. 各サンプル(例:ウサギRFP 1:2000またはチキンGFP 1:2000)に1 mLの一次抗体溶液を調製します。抗体溶液に抗体を添加し、短時間ボルテックスした後、4,000 x g、4°C、≥で5分間遠心分離します。一次抗体の切片を振とうしながら、4°Cで2〜3晩インキュベー
トします。
6. 一次抗体のインキュベーション後、1日目のTBSTをウォッシュウェルから吸引し、各ウォッシュウェルに新しいTBSTを1 mL加え、切片を最初のウォッシュウェルに移します。切片を3回、各10分間洗浄します
   手記：吸引には、真空フラスコにチューブを接続した9インチパスツールピペットを使用します。家庭用真空ラインまたは電動真空ポンプを真空源として使用できます。
7. 切片を洗浄している間に、抗体溶液(例えば、ヤギ抗ウサギ594またはヤギ抗ニワトリ488)に抗体を添加することにより、1:200の濃度で二次抗体溶液を調製します。短時間渦巻いた後、4°Cで≥4,000 x gで5分間回転します。
8. 二次抗体の切片を室温で3時間インキュベートします。このステップとその後のすべてのステップでは、切片を光から保護して、二次抗体の漂白を軽減します。
9. 二次抗体インキュベーション後、2日目のTBSTをウォッシュウェルから吸引し、各ウォッシュウェルに新しいTBSTを1 mL加え、切片を最初のウォッシュウェルに移します。切片をTBSTで3回、それぞれ10分間洗浄します。
10. 最終洗浄時には、封入剤を4°Cから取り出し、室温まで温めます。2x TBS:蒸留水の1:1の混合物を準備し、これをペトリ皿に加えます。800 μL の 2:1 TBS:dH₂O を表面に添加して顕微鏡スライドを調製します。
    手記：非硬化性の封入剤を使用することを強く推奨します。封入剤を硬化させると、組織の体積が変化し、アストロサイトのテリトリー体積の分析が混乱する可能性があります。シンプルで安価な自家製封入剤のレシピは、材料の表に記載されています。
11. 細い絵筆を使用して、Wash 3ウェルから一度に1つずつセクションをペトリ皿に移します。この手順により、トリトンが取り除かれ、セクションが平らになります。次に、ペトリ皿からスライド上の液体に切片を移します。
12. ペイントブラシを使用して、セクションがスライド上で平らになるようにセクションを配置します。P1000ピペットでスライドから余分な液体を慎重に取り除き、続いて真空吸引します
    手記：パスツールピペットの端にP200ピペットチップを追加すると、真空吸引をより細かく制御できます。
13. スライドから余分な液体をすべて取り除いたら、トランスファーピペットを使用して、すぐに各セクションに1滴の封入剤を追加し、スライド上にカバースリップを静かに敷きます。封入剤を数分間広げてから、カバーガラスの下から出てきた余分な封入剤を真空吸引で取り除きます
    手記：封入剤を追加する前に、切片を乾燥させないでください。封入剤を添加する前に切片が乾燥し始めると、組織の体積に影響を与え、正確なデータ収集が妨げられる可能性があります。
14. カバースリップの4つの端すべてを透明なマニキュアで密封します。スライドを室温で30分間乾燥させ、4°Cで平らに保管します。少なくとも2時間待ってからイメージングするか、翌日にイメージングします
    注:GFP(緑色蛍光タンパク質)およびRFP(赤色蛍光タンパク質)に対する抗体で染色された切片は、マニキュアで完全に密封されている場合、イメージング前に最大2週間保存できます。

結果

図1:アストロサイトのテリトリーボリュームを分析するためのワークフローの概要。(A)このプロトコルには、アストロサイトのスパースまたはモザイク蛍光標識を施したマウスが必要です。(B)マウスを灌流し、その後、脳を切除、処理、凍結します。(C)凍結した脳をクライオスタットで切片化し、(D)自由浮遊組織切片を採取します。(E)切片化後、浮遊組織切片を免疫組織化学で染色し、(F)スライドにマウントします。(G)マウントされた組織切片内のアストロサイトは、共焦点顕微鏡を使用してイメージングされます。(H)最後に、画像解析ソフトウェアを使用...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10x TBS(トリスバッファー生理食塩水)			Tris:30 g、NaCl:80 g、KCl:2 g、HCl:pH 7.4、dH2O:1 L;室温(RT)で保存
12ウェルプレート	ジェネシー・サイエンティフィック	25-106メガピクセル
1x TBSの			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O;RTで保存
24ウェルプレート	ジェネシー・サイエンティフィック	25-107メガピクセル
CD1マウス	チャールズ川	22
共焦点顕微鏡	オリンポス	FV3000RS
カバースリップ	フィッシャーサイエンティフィック	12544Eメール
ダピ	インビトゲン	D1306
GFP抗体	エイブスラボ	GFP1010
グリセロール	サーモサイエンティフィック	158920010
ヤギのアンチチキン488	インビトゲン	A-11039
ヤギ反ウサギ594	インビトゲン	A11037 (英語)
ヤギ血清	ギブコ	16210064
イマリス	ビットプレーン	該当なし	バージョン 9.8.0
MATLAB	MathWorksの	該当なし
マニキュア	VWRの	100491から940
O.C.T.(オ・シー・ティー)	フィッシャーサイエンティフィック	23-730-571
油	オリンポス	イモイル-F30CC	顕微鏡/対物レンズ専用
操作はさみ6インチ	ロボズ	RS-6820
オービタルプラットフォームシェーカー	フィッシャーサイエンティフィック	88861043	必要な最小速度:25 rpm
絵筆	ボグリヌオ	該当なし	Amazonから、「ディテールペイントブラシ-ミニチュアブラシ」
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	P6148
パスツールピペット(5.75インチ)	VWRの	14672-608
パスツールピペット(9インチ)	VWRの	14672-380
塩化カリウム	シグマ・アルドリッチ	P9541-500G
RFP抗体	ロックランド	〒600-401-379
スライド	VWRの	48311-703
クルロイドナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	BP358-212
水酸化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S5881
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	S0389
トランスファーピペット	VWRの	414004から002
トリブロモエタノール	シグマ・アルドリッチ	T48402
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン	サーモサイエンティフィック	424570025
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	93443
Triton X-100 (高品質)	フィッシャーサイエンティフィック	50-489-120