ヒトの死後小脳組織からプルキンエ細胞を分離するためのレーザーキャプチャマイクロダイセクション

要約

出典:Martuscello, R. T., L. et al., A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、ヒトの死後小脳組織からプルキンエ細胞を単離する方法を示します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 組織切片

1. 切片化のために組織の小片(~1cm x 1 cm)をカットします。残りの組織をドライアイス/-80°C冷凍庫に戻します.
   手記：組織切片がプルキンエ細胞が位置する~95%の小脳皮質であることを確認してください。
2. 「チャック」を覆うように、高さ約3mmのOCTのマウンドを置きます。小さなマウンドができるまで、ゆっくりと円を描くように上にレイヤーを構築することから始めます。
3. OCTが部分的に凍結したが、中央にまだ液体が残っている場合は、その上にティッシュを置きます。ティッシュをOCTに深く押し込まないでください。ティッシュを完全に凍らせるまで、その上に置いておきます(これには1〜2分かかります)。
4. 凍結OCTと組織を入れた「チャック」をクライオスタットカッティングアームに入れます。ティッシュがカッティングブレードと同じ高さになるように調整します。
5. 組織をカッティングアームに15〜20分間置いて、新しい温度に調整します
   手記：組織の厚さにもよりますが、温度順応には時間が必要です。ティッシュをきれいに切るために必要なだけ長く置いておきます。OTとCTを調整して、組織の温度順応を支援します。
6. ティッシュをゆっくりとブレードに近づけます。ティッシュがブレードに到達したら、トリミングプロセスを開始します。トリムの厚さは30μmに設定する必要があります。
7. 皮質層が見えるまで2〜3倍にトリミングします。
8. アンチロールプレートをクライオスタットブレードのすぐ上に置き、位置合わせします.
   手記：ブレードとアンチロールプレートの界面にあるクライオスタットの光から銀色の線が表示されます。これは、アンチロールプレートがブレードのエッジの真上にあることを示しています。
9. 14 μmで切片の切断を開始します。適切に切断された切片は、アンチロールプレートの下で平らになります。
   手記：ティッシュが詰まっている場合は、アンチロールプレートが十分に冷えていることを確認してください。必要に応じて、ドライアイスを外側(ステージに触れていない側)に置くと、アンチロールプレートが急速に冷えます。
10. 4〜6個の切片をカットし、クライオスタットステージを横切って水平に整列させます。
11. スライドを傾けて、一度にティッシュのすべての部分を拾い上げます.
    手記：ブラシを使用して、ティッシュの端を持ち上げて、ピックアップ時にスライドしやすくします。一度に1つのセクションをピックアップしないでください。室温の空気にさらされると、RNAの完全性が低下します
    注意：メンブレンがクライオスタットのステージに触れないようにしてください。メンブレンがステージに接触すると、スライドガラスから剥がれ始め、LCMを試みるときにエラーが発生します。
12. すぐにステップ6に進みます。固定を遅らせないでください。

2. 組織固定/汚れのない可視化

1. すぐにエタノール固定プロトコルに移行します
2. スライドを70%エタノールを入れたスライドホルダーに2分間、氷の上に置きます。
3. スライドを95%エタノールを入れたスライドホルダーに45秒間、氷の上に置きます。
4. スライドを100%エタノールを入れたスライドホルダーに2分間置きます—RTで。
5. スライドをキシレン1を入れたスライドホルダーに3回浸します—RTで。
6. スライドをキシレン2を入れたスライドホルダーに5分間、RTで置きます。
7. 清潔な場所で少なくとも30分間乾燥させます。乾燥時間は60分までと長いのが最適です
   注意：ドラフトで乾燥させるには、スタンドアップスライドを使用してください。キシレンは揮発性です。スライドを平らに置くと、キシレンが組織切片に溜まり、組織が暗くなりすぎます。

3. 保存されているスライドを解凍して使用する

1. 使用目的の1時間前に、-80°C冷凍庫からシングルスライドでチューブを取り外してください。
2. すぐにチューブを開けないでください。チューブを室温に戻します。結露はチューブの外側にのみ発生します。
3. チューブが室温に達し、すべての結露がなくなったら(約30〜40分)、キャップを取り外し、スライドを室温の空気にさらします。
4. スライドを室温に15〜20分間順応させます。次に、キャップを外した状態でチューブ内に置いておきます。
   手記：これで、スライドを LCM に使用できるようになりました。

4. レーザー捕獲によるプルキンエ細胞の顕微解剖:

注:このプロトコルセクションでは、その後のRNAシーケンシングのためのプルキンエ細胞の捕捉に関連する詳細についてのみ説明します。このセクションでは、ユーザーがUVレーザーキャプチャ顕微鏡および関連ソフトウェアに精通していることを前提としています。

1. 顕微鏡ステージとキャップコレクションアームをRNase除染器で清掃します。
2. 手袋をはめた手で、スライドを顕微鏡に置き、500μLの不透明なキャップをコレクションアームに置きます.
   手記：RNase除染装置で作業領域を清掃し、手袋をはめた手でスライドキャップまたは不透明なキャップに触れることで、常に適切なRNA技術を確保してください。スライドとキャップを所定の位置に置き、レーザーキャプチャを開始したら、手袋を取り外すことができます。
3. 低倍率で、不透明なキャップを小脳組織に合わせ、キャップが接眼レンズで視覚化された領域全体を覆うようにします。
   手記：不透明なキャップが中央に配置されているかどうかは、顕微鏡の接眼レンズのみに表示されます。カメラは、キャップがティッシュの中央に配置されているかどうかを表示しません。レーザーキャプチャスコープの設計に応じて、不透明なキャップを介した視覚化は、接眼レンズのみに行われるか、接眼レンズとカメラの両方で視覚化されます。
4. 5倍から10倍の対物レンズで小脳層を可視化し、分子層と顆粒細胞層が交差する部分(プルキンエ細胞層)にカーソルを置きます。
5. 40Xに移行してプルキンエ細胞を可視化する.
   手記：視覚化の例については、図 1 と図 2 を参照してください。
6. プルキンエ細胞の捕獲を開始します.
   手記：RNAシーケンシングを行うには、少なくとも5 ngのRNAが必要です。約1600〜2000個のプルキンエ細胞は、シーケンシングに十分なRNA材料を生成します。RNAは顕微鏡で最大8時間安定です。収集前にUVエネルギーとUVフォーカスをテストして、レベルが正しいことを確認します。時間が経つにつれて、組織は乾燥し続け、UVエネルギーとUVフォーカスを変更する必要がある場合があります。

結果

図1:キシレン処理の有無にかかわらず、小脳層とプルキンエ細胞の可視化。エタノール固定および脱水後のキシレンの有無の代表的な画像。分子層(ML)と顆粒細胞層(GCL)にはラベルが付けられています。プルキンエセルは矢印でマークされています。(A)キシレンを使用しない小脳層の視覚化の5倍表現。スケールバー:10μm.(B)キシレンによる小脳層の視覚化の5倍表現。スケールバー:10μm.(C)キシレンを使用しない小脳層の視覚化の40倍表現。スケールバー:1μm.(D)キシレンによる小脳層の視覚化の40倍表現。スケールバー:1μm

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
メンブレンスライド NF 1.0 PEN	ツァイス	415190-9081-000	組織用のメンブレンスライド。スライドガラスの使用はお勧めしません。
AdhesiveCap 500 オペーク	ツァイス	415190-9201-000	不透明なキャップは、反転スコープの視覚化を強化するために使用されます
RNaseアウェイ	分子バイオプロダクツ	7005-11	他のRNase除染製品も適しています。作業前にすべての表面を清掃するために使用します。
200プルーフエタノール	デコン研究所	2701	代替エタノールを使用する場合は、高品質を確保してください。組織の固定に不可欠です。
キシレン(ACS認定)	フィッシャーサイエンティフィック	X5P-1GAL	代替キシレンを使用する場合は、高品質を確保してください。組織の可視化に欠かせません。
UltraPure蒸留水	インビトゲン	10977-015	他のRNA / DNA /ヌクレアーゼフリーウォーターも適しています。エタノール希釈のみで利用されます。
スライドフィックススライドジャー	常緑	240-5440-G8K	任意のスライドホルダー/ジャー容器も適しています。使用前に清掃する必要があります。切片化後の固定に使用されます。
アンチロールプレート、Assy. 70mm 100um	ライカバイオシステムズ	14041933980	アンチロールプレートの種類は、クライオスタットの種類とステージ上の取り付け位置によって決まります。すべてのクライオスタットには異なる要件があります。
キムワイプ	フィッシャーサイエンティフィック	06-666A	キムワイプはどのベンダーからでも注文でき、任意のサイズで使用できます。キムワイプは、顕微鏡やクライオスタットの清掃に使用します。
ティッシュプラスOCTコンパウンド	フィッシャーサイエンティフィック	23-730-571	OCTのどのブランドでも使用できます。OCTにはティッシュが埋め込まれることはなく、組織を「チャック」に付着させるのは簡単だ。
Edge-Riteロープロファイルミクロトームブレード	サーモサイエンティフィック	4280L	ブレードの種類は、クライオスタットの種類によって決まります。すべてのクライオスタットには異なる要件があります。
ライカ マイクロシステムズ 3P 25 + 30MM クライオスタットチャック	フィッシャーサイエンティフィック	NC0558768	チャックの種類は、クライオスタットの種類によって決まります。すべてのクライオスタットには異なる要件があります。どちらのサイズでも適切です。