ダウンストリーム解析のためのマウス脳の処理

要約

出典:Wager-Miller, J. et al.Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp (2020)

このビデオでは、ダウンストリーム分析のために凍結マウス脳組織切片を準備するための詳細なステップバイステップのプロトコルを示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 頭脳の保存

1. 従来のアプローチを使用して、体重約30 gの安楽死成体CD1野生型マウスから脳を迅速に取り出し、ドライアイスで予め冷却した液体窒素またはイソペンタンのいずれかで60秒間急速凍結します。
2. 凍結した脳は、使用するまで-80°Cでアルミホイルまたは円錐管で保存してください。

2. 脳マトリックスの準備

1. 組織を解剖する24時間前に、解凍したフリーザーパックの山にきれいな脳マトリックスを置きます。マトリックスの側面を2つのフリーザーパックの間に挟み込み、カミソリのスロットの底とゲルパックの上部との間に約0.5cmの間隔を空けます(図1A)。冷却を助けるために端にアルミホイルを置きます。
   注:脳マトリックスを購入するときは、解剖する脳の全容積を包み込むのに十分な大きさのものを購入してください。
2. ブレインマトリックスとフリーザーパックが入った箱を-20°Cの冷凍庫に入れ、上部を半開きにして一晩寝かせます。

3. 冷凍ガラス皿のセッティング

注: この設定の目的は、脳切片を解剖するための凍結した表面を準備することです。

1. 上部から約5cmまでの断熱ボックスに氷を入れます。次に、氷の上にドライアイスの2.5 cmの層を置き、サンプルの視覚化を助けるために黒いプラスチックシートで覆います(図1B、図1C)。
2. プラスチックの上にガラスプレート(箱の開口部にちょうど収まるはずです)を置き、プレートの一番上の隅にドライアイスを置きます(図1C)。
3. 冷凍庫から凍結した脳マトリックスを取り出し、皮質側を上にして切断する脳を挿入します。ボックス内の温度まで10分間平衡化させます。この間、箱に蓋をしたままにしてください。
4. 冷たい鉗子でマトリックス内の脳の位置を調整し、矢状洞と横静脈洞がブロックの垂直な溝と揃うようにします (図 1Dこれにより、対称的な切片を確保し、解剖が容易になります。鉗子の先端をドライアイスに軽く触れて冷やしてから、脳を調整します。
5. 脳が所定の位置に配置されたら、冷やしたカミソリの刃をその中心近くに置き、刃を組織に約1mm押し込みます。吻側と尾側の端に冷やしたブレードを追加して、脳を所定の位置に保持します(図2Aおよび図2B)。
6. 吻側の端から始めて、ブレードを1枚ずつ追加し、スロットに配置して、組織に約1mmゆっくりと押し込みます(図2B)。尾側の端に向かって1mm間隔でブレードを追加し続けます。
7. この間、脳が動かないように注意してください。ブレードを水平と垂直に並べます(図2B)。ロープロファイルのミクロトームブレードを使用して、切片を0.5mm幅に切断できます。これらを大きい方のカミソリの刃の間に置きます (図 2C
8. ブレードが所定の位置に配置されたら、指、手のひら、またはその他の平らな面でグループの上部を押し下げます(図2C、図2D)。ブレードのグループをゆっくりと左右に揺らして、組織内を移動します。
   注:これには時間がかかる場合があり(1〜2分)、忍耐が必要です。ブレードが組織内を移動するのに抵抗があるはずです。簡単に入ることができるということは、脳が解凍され、ブロックをドライアイスで冷やす必要があることを意味します。
9. すべてのブレードがスロットの底に達したら、ブレードのグループの両側をつかみ、前後に揺らしてマトリックスから解放されます。
   注:刃の鋭いエッジで自分を切らないように注意してください。
10. グループが自由になったら、吻側を上にしてスタックをガラス板に置きます(図2E)。ドライアイスをスタックの横や上に置くと、サンプルをさらに凍結して分離が容易になります。
11. 鋭いエッジでスタックをガラスプレートに置き、親指と指の間でスタックを移動させてブレードを分離します。ブレードは、セクションが取り付けられた状態で互いに分離する必要があります。
12. 吻側から尾側までガラス板上のセクションを並べます(図2F)。
13. 指の間でブレードを曲げるか、2つ目の冷たいカミソリで分離することにより、組織をブレードから分離します(図2G、2H、2I)。

4. セクションの解剖

1. Allen Mouse Brain Atlasまたは別のリファレンスを開き、関心領域を特定するために必要なランドマークを見つけます。いくつかの明らかなランドマークには、前交連、脳梁、側脳室、海馬が含まれます(図3)。
2. 冷やした鉗子で切断する部分を反転させ、収集しようとしている領域が全体で一貫していることを確認します。収穫中は、参照アトラスを頻繁に参照して、正しいROIが得られることを確認してください。
   注: このプロセスでは、虫眼鏡または解剖顕微鏡が役立つことがよくあります。また、照明の良さも欠かせません。この目的には、低ワット数のLEDランプまたはクールランプを使用できます。
3. きれいなメスまたはパンチで、セクションに切り込みを入れます(図4)。各ツールを事前に冷却してから、ドライアイスに短時間触れて切断します。ブレードを組織に優しく、しかししっかりと押し込み、前後に揺らしてカットします。強く押しすぎると、組織が壊れます。
   注: ツールは時間の経過とともに温まります。ブレードを少し温めると、きれいに切り傷をし、骨折を抑えることができますが、組織が解凍されないように注意してください。定期的にツールをドライアイスで冷やします。
4. ROIが回収されたら、ラベルを貼った予冷済みの1.5 mLチューブに入れます。採取したティッシュは、必要になるまで-80°Cで保存してください。

結果

図1:凍結した作業面の準備。(A)ブレインブロックは、断熱ボックス内のゲルパックのスタックに置かれ、次に2つの追加のゲルパックの間に挟まれます。アルミホイルは、切片作成中の冷却を容易にするために、ブロックの両端に詰められています。その後、ボックスは-20°Cで一晩冷却されます(B)ガラス板は、断熱ボックスの開口部とサイズが一致します。この目的には、配送ボックスを使用できます。氷を上から約5cmになるまで箱に加えます。次に、箱を-20°Cで一晩凍結します(B、C)組織を収集する直前に、ドライアイスの均一な層を氷の上の深さ約2.5cmに置きます。黒いプラスチックのシート(視覚化を助けるため)をドライアイスの上に置きます、続いてガラスプレートを置きます。ドライアイスは遠い隅に置かれ、プレートのすぐ上の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5 mmマウス冠状脳マトリックス	ブレインツリー・サイエンティフィック	BS-SS 505C	カッティングブロック
0.5 mmラットコロナル脳マトリックス	ブレインツリー・サイエンティフィック	BS-SS 705C	カッティングブロック
プランジャー付き1.0mm生検パンチ	電子顕微鏡科学	69031から01
1.5 mL微量遠心チューブ	ドットサイエンティフィック	229443	凍結されたROIの保存用
プランジャー付き1.5mm生検パンチ	電子顕微鏡科学	69031から02
プランジャー付き2.0mm生検パンチ	電子顕微鏡科学	69031から03
4-12% NuPageゲル	インビトゲン	NPO323BOX	タンパク質グラジエントゲル
バイオアナライザーシステム	アジレント	2100	RNA解析システム
ダウンスティッシュグラインダー	ミリポアシグマ	D8938	ガラス組織ホモジナイザー
ファイバーライト	ドラン・ジェンナー・インダストリーズ株式会社	モデル180	クールランプ
ガラスプレート	LabRepCo(ラボレプコ)	11074010
ロープロファイルブレード	サクラファインテックUSA社	4689