ダウンストリーム解析のためのマウス脳の処理

要約

出典:Wager-Miller, J. et al.Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp (2020)

このビデオでは、ダウンストリーム分析のために凍結マウス脳組織切片を準備するための詳細なステップバイステップのプロトコルを示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 頭脳の保存

1. 従来のアプローチを使用して、体重約30 gの安楽死成体CD1野生型マウスから脳を迅速に取り出し、ドライアイスで予め冷却した液体窒素またはイソペンタンのいずれかで60秒間急速凍結します。
2. 凍結した脳は、使用するまで-80°Cでアルミホイルまたは円錐管で保存してください。

2. 脳マトリックスの準備

1. 組織を解剖する24時間前に、解凍したフリーザーパックの山にきれいな脳マトリックスを置きます。マトリックスの側面を2つのフリーザーパックの間に挟み込み、カミソリのスロットの底とゲルパックの上部との間に約0.5cmの間隔を空けます(図1A)。冷却を助けるために端にアルミホイルを置きます。
   注:脳マトリックスを購入するときは、解剖する脳の全容積を包み込むのに十分な大きさのものを購入してください。
2. ブレインマトリックスとフリーザーパックが入った箱を-20°Cの冷凍庫に入れ、上部を半開きにして一晩寝かせます。

結果

図1:凍結した作業面の準備。(A)ブレインブロックは、断熱ボックス内のゲルパックのスタックに置かれ、次に2つの追加のゲルパックの間に挟まれます。アルミホイルは、切片作成中の冷却を容易にするために、ブロックの両端に詰められています。その後、ボックスは-20°Cで一晩冷却されます(B)ガラス板は、断熱ボックスの開口部とサイズが一致します。この目的には、配送ボックスを使用できます。氷を上から約5cmになるまで箱に加えます。次に、箱を-20°Cで一晩凍結します(B、C)組織を収集する直前に、ドライアイスの均一な層を氷の上の深さ約2.5cmに置きます。黒いプラスチックのシート(視覚化を助けるため)をドライアイスの上に置きます、続いてガラスプレートを置きます。ドライアイスは遠い隅に置かれ、プレートのすぐ上の.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5 mmマウス冠状脳マトリックス	ブレインツリー・サイエンティフィック	BS-SS 505C	カッティングブロック
0.5 mmラットコロナル脳マトリックス	ブレインツリー・サイエンティフィック	BS-SS 705C	カッティングブロック
プランジャー付き1.0mm生検パンチ	電子顕微鏡科学	69031から01
1.5 mL微量遠心チューブ	ドットサイエンティフィック	229443	凍結されたROIの保存用
プランジャー付き1.5mm生検パンチ	電子顕微鏡科学	69031から02
プランジャー付き2.0mm生検パンチ	電子顕微鏡科学	69031から03
4-12% NuPageゲル	インビトゲン	NPO323BOX	タンパク質グラジエントゲル
バイオアナライザーシステム	アジレント	2100	RNA解析システム
ダウンスティッシュグラインダー	ミリポアシグマ	D8938	ガラス組織ホモジナイザー
ファイバーライト	ドラン・ジェンナー・インダストリーズ株式会社	モデル180	クールランプ
ガラスプレート	LabRepCo(ラボレプコ)	11074010
ロープロファイルブレード	サクラファインテックUSA社	4689