早期椎間板疾患をシミュレートするための臓器培養モデルの生成

要約

出典: Saravi, B. et al., A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、TNF-αを使用した早期椎間板(IVD)疾患の炎症誘発性および変性臓器培養モデルの開発を示しています。TNF-αを椎間板に注入する手順を概説し、TNF-αがIVDの炎症と分解を誘発するメカニズムを説明しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 椎間板(IVD)の培養とローディング

1. 椎間板(IVD)をIVDチャンバーに移し、IVD培養培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM、生理学的グループで4.5 g / L高グルコースDMEM、病理グループで2 g / L低グルコースDMEM)+ 1%ペニシリン/ストレプトマイシン+ 2%ウシ胎児血清+ 1% ITS(5 μg / mLインスリン、 6 μg/mLトランスフェリン、および5 ng/mLセレン酸)+ 50 μg/mLアスコルビン酸-2-リン酸 + 1%非必須アミノ酸 + 50 μg/mL 初代細胞用抗菌剤)を37°C、湿度85%、CO₂のインキュベーターに入れます。
2. 実験グループに従って、バイオリアクターシステム内でディスクを4日間培養します。病理学的グループでは、0.32-0.5 MPa、5 Hzで2時間/日の変性負荷条件を維持します。生理学的対照群では、0.02-0.2 MPa、0.2 Hzの負荷プロトコルを2時間/日使用します。
   注:ローディング手順では、IVDを5 mLのIVD培地が入ったチャンバーに配置します。容量は、バイオリアクターのローディングチャンバーのサイズによって異なります。ローディング手順の合間に、IVDを7 mLのIVD培地を入れた6ウェルプレートに入れて、自由に膨潤回復させます。
3. 実験期間中の椎間板の高さの変化を分析するには、IVD 解剖後 (ベースライン) と、自由腫脹期間後および実験期間中の動的負荷後に毎日、キャリパーで椎間板の高さを測定します。

2. 椎間板内腫瘍壊死因子α(TNF-α)注射

1. 1日目の最初の動的負荷サイクルの直後に、IVDをペトリ皿に垂直位置に置き、ピンセットでIVDを安定させます。
2. 組換え TNF-α (IVD あたり 70 μL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に 100 ng) を 30 ゲージのインスリン針とともに、病理学的グループの髄核組織に注入します。約70μLの速度で1分でゆっくりと注入します。
3. 注射後、シリンジをIVD内で半分引き戻し、シリンジプランジャーを引いて真空を作り、注入した溶液が漏れないようにしてから、針とシリンジをIVDから完全に取り外します。
   注: トリパンブルー色素を含むPBSを注入してパイロット実験を行い、ローディングと一晩の培養後に注入された溶液の分布を評価します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アスコルビン酸-2-リン酸	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	A8960
TNF-α、組換えヒトタンパク質	R&D systems、ミネソタ州、米国	210-TA-005
ウシ IL-8 日夜のことごと ELISA	Kingfisher Biotech, St. Paul, USA	DIY1028B-003
コーニング ITSプレミックス	Corning Inc.、ニューヨーク、アメリカ	354350
DMEM高グルコース	Gibco by life technologies, カールスバッド, USA	10741574
DMEM低グルコース	Gibco by life technologies, カールスバッド, アメリカ	11564446
分子生物学用エタノール	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	09-0851
ウシ胎児血清(FBS)	Gibco by life technologies, カールスバッド, アメリカ	A4766801
非必須アミノ酸溶液	Gibco by life technologies, カールスバッド, USA	11140050
ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)	gibco by life technologies, カールスバッド, アメリカ	11548876
リン酸緩衝液、錠剤	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P4417
プリモシン	InvivoGen、サンディエゴ、アメリカ	ant-PM-05