ラテラル流体打楽器装置を用いたラットモデルにおける外傷性脳損傷の誘発

要約

出典:McGuire, M. J., et al.横方向の流体パーカッション誘発性外傷性脳損傷後のてんかん様放電を監視するためのワイヤレスビデオEEGシステムの使用。J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、側方輸液打楽器損傷(FPI)デバイスを使用したラットの外傷性脳損傷(TBI)の誘発を示しています。この手順では、麻酔をかけたラットの頭蓋骨に穴を開けて硬膜を露出させ、その上にカニューレを取り付けます。その後、ラットはデバイスに接続され、圧力波が発生して脳に到達し、神経細胞の死と血管障害を引き起こすことでTBIを模倣します

プロトコル

1. 流体打楽器による損傷

1. 白衣または手術用ガウン、サージカルマスク、サージカルグローブ、ヘッドカバーを着用し、手術部位に接触するすべてのツールと材料を滅菌します。
2. 10〜12週齢の雄のWistarラット(350〜400 g)を、ラットに適したサイズの誘導チャンバーで3%イソフルランと1 L / min酸素で麻酔します。ラットを誘導室から取り出し、意識を失ったら準備エリアに移動します。滅菌点眼軟膏を両目に入れます。.
3. #40ブレードを備えた電気バリカンでラットの頭の毛を剃り、目の真上から耳の尾側基部まで剃り、十分な手術野を作り出します。緩んでクリップされた髪をサイトから取り除きます。
4. 剃った頭皮に2%クロロヘキシジンスクラブを塗布し、続いて70%エタノールを塗布して、手術部位を洗浄します。中心から始めて、切開部位から同心円状に外側に移動します。このプロセスを3回繰り返します。同じ方法でベタジン溶液を部位に塗布し、乾燥させます。
5. 麻酔をかけたラットを定位固定装置フレームに置き、ノーズコーンを介して麻酔を2〜3%イソフルラン-1 L / min酸素に保ちます。.後肢の離脱反射の喪失と眼瞼反射の喪失をチェックして、ラットが麻酔の手術面にあることを確認します。
6. 手術中、呼吸数、心拍数、体温、酸素飽和度をモニタリングします。心拍数を300〜400 bpm、SpO₂を90%以上に維持します。
   手記：後足部に取り付けられたパルスオキシメータを使用して、心拍数とSpO₂を常に読み取ることができます。心拍数が400 bpmを超える場合は、ラットに十分な麻酔がかけられていないことを示します。直腸体温計と組み合わせた自己調整式加温パッドを37°Cに設定すれば、手術中はラットの下に設置して体温を維持することができます。光源と光ファイバーランプを組み合わせた実体顕微鏡は、手順を視覚化するのに役立ちます。
7. 23 gの針を使用して、切開を行う10〜15分前に、切開部位の切開部位で0.5%塩酸ブピバカインを頭皮内に注射します。.
8. #10メスブレードを使用して、頭皮の皮膚と筋肉に1.5〜2.5cmの正中線を切開します。皮膚と筋肉を引っ込めて頭蓋骨を露出させ、明確な手術野を提供します。滅菌綿棒で下にある筋膜と脂肪組織を骨から遠ざけて反射します.
   手記：電気焼灼ユニットは、迅速な止血を実現するのに役立ちます。
9. 外科的キュレットを使用して左頭頂骨の外側隆起を削り、滑らかな平らな表面を作り、女性-女性のルアーロックハブの基部が頭蓋骨と同じ高さで休むことができるようにします。
10. 頭蓋骨表面と周囲の組織を滅菌生理食塩水中の2.0 mg / mLゲンタマイシン溶液で洗浄します。.滅菌綿棒で余分な溶液を吸い取ります。
11. 頭蓋骨に3%の過酸化水素を塗布して骨を乾燥させます。
    手記：骨が十分に乾燥していないと、歯科用セメントが適切に接着せず、しっかりとしたシールが形成されます。
12. 左頭頂骨を通る直径5mmの頭蓋切除部位を作成します。
    手記：定位フレームに取り付けられた電動ドリルにトレフィンビットを入れると、頭蓋切除術を開始するのに役立ちます。直径5mmのトレフィンを備えたハンドドリルを使用して、残りの骨を通して頭蓋切除術をゆっくりと終了します。頭蓋切除術の完了が近づいたら、トレフィンを逆回転させて、下にある硬膜の破裂を防ぎます。ディスクの周囲で頭蓋骨が薄くなり、軽く押すと頭蓋骨フラップが緩く感じます。
13. 外科用掻爬器と平滑組織鉗子で骨フラップを取り外し
    手記：多少の出血が起こることがありますが、滅菌綿棒で穏やかな圧力をかけることで止血を迅速に行うことができます。
14. 実体顕微鏡と照明を使用して、硬膜の破裂の兆候がないか目視検査します。頭蓋切除部位の周囲には薄い骨の縁が残ります。硬膜を破裂させないように注意しながら、滑らかな組織鉗子でこの縁を優しく取り除きます。
15. 頭蓋骨を70%エタノールで綿棒で拭き取り、骨のほこりを取り除き、頭蓋骨を乾燥させます。
16. ルアーロックハブの下端にシアノアクリレートゲル接着剤の薄層を塗布し、開口部を塞がずに頭蓋骨切除術の頭蓋骨に固定します。接着剤を硬膜に接触させないように注意してください。さらに、ハブの外側のベースの周りに接着剤の薄い層を追加して、ルアーロックを所定の位置に密封します。
17. 歯科用セメントのスラリーを準備します。ルアーロックハブの基部の周りと基部の頭蓋骨の表面にセメントを塗布して、所定の位置に固定します。
18. 注射器と針を使用して、ルアーロックハブに滅菌防腐剤を含まない人工脳脊髄液(CSF)溶液(pH 7.4)を充填し、生理食塩水の凸状ボーラスがリムの上部の上に見えるようにします
    手記：このソリューションは、歯科用セメントが乾燥しても硬膜を湿らせ続けるだけでなく、シールの完全性を示すものとしても機能します。溶液レベルが少しでも低下した場合は、システムの漏れを示しているため、ルアーロックを取り外して交換する必要があります。
19. 歯科用セメントが完全に硬化したら、ガス麻酔を中止し、ラットを定位固定装置フレームから取り外します。
20. ラットをFPIデバイスの隣のプラットフォームに置きます。
21. FPIデバイスには、流体リザーバーの端にある圧力トランスデューサーから伸びる湾曲した金属チップがあります。長さ12 cmのプレッシャーチューブを湾曲した先端の端に固定し、反対側の端を2 cmのオスのルアーロックツイストコネクタで終端します。ラットの頭蓋骨のハブの女性側を男性コネクタに接続して、ラットをFPIデバイスに固定します。
    手記：接続がしっかりと固定されていること、およびすべての気泡がシステムから除去されていることを確認してください。
22. 動物を胸骨の横臥位に置き、離脱反射の再発を繰り返し確認します。.ラットが離脱反射を取り戻したが、まだ鎮静状態にあるとすぐに、FPIデバイスの振り子を解放して、単一の20ミリ秒の圧力パルスを引き起こし、損傷を誘発します
    手記：動物が深く麻酔されている間は、神経原性肺水腫による死亡率の増加を引き起こす傾向があるため、損傷を誘発しないことが重要です。すべてのデバイスはばらつきを示します。しかし、この実験に用いた装置では、ハンマーを17°の角度で配置すると、2.2〜2.3の大気圧パルスが生成されます。負傷していない偽の動物は、実際の流体パルスを除いて、誘発された傷害に対してすべて同じ手順を受けます。
23. 損傷後すぐにラットをFPIデバイスから外し、胸骨の横臥位に置き、自発呼吸が戻るまでノーズコーンを介して酸素補給(1 L /分)を提供します。.無呼吸は、怪我の予想される結果です。必要に応じて、ラットが自発的に呼吸し始めるまで、バッグバルブマスクを介して定期的な手動呼吸を提供します。
    手記：通常、無呼吸は2分未満続きます。カテコールアミンバーストによる圧力パルスの投与直後に、心拍数の一時的な急速な上昇(>500 bpm)が観察されます。.これは、ラットの足に取り付けられたパルスオキシメータで監視でき、重傷を負ったことを示す可能性のある指標として機能します。
24. ラットを継続的に監視し、直立反射(4つの手足すべてで安定した歩行)の復帰時間を記録します。
25. 各ラットの大気圧パルスの大きさは、互いに±0.05気圧以内である必要があります。各圧力パルスが、一貫した振幅と持続時間でオシロスコープ上で滑らかな信号を生成することを確認します。
    手記：ノイズの多い信号は、損傷パルスを送達する前に除去する必要があるシステム内の気泡を示している可能性があります。この実験で重傷を負わせる大気圧パルスは、通常、動物の立ち直り時間が30〜60分になるパルスです。この範囲の正しい時間は、約40〜50%)の死亡率と関連しています。
26. 支持療法として、温めた生理食塩水10mLを皮下投与します。
27. ラットをホームケージに戻し、少なくとも4時間回復させます
    手記：ラットをすぐに麻酔下に戻すと、死亡率の増加が観察されています。.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.00mmドリルビット	ドリルビットシティ:新しい超硬工具	05M200
3M ESPEデュレロンカルボン酸セメント	3M , ノイス ドイツ	38019	歯科用セメント
4-0 縫合糸	エチコン、ニュージャージー州サマービル	K831Hの	4-0 Ethicon パーマハンド シルク、26mm 1/2c テーパーポイント、30" (75cm)、ブラック ブレイド非吸収性縫合
外径5mmトレフィン	ファインサイエンスツール	18004-50
デュモン #6 鉗子	ファインサイエンスツール	11260から20
デュモン #7b 鉗子	ファインサイエンスツール	11270から20
ecgAUTO	EMKA Technologies、バージニア州フォールズチャー
メスルアースレッドスタイルカプラークリアポリカーボナーレ	コール・パーマー楽器	SKO#45501-22	注文ロット #214271
フットパワードリル	Grobet USA、ニュージャージー州カールスタット	モデルC-300
GentaMax 100(ゲンタマイシン、硫酸塩溶液)	フェニックス、クリッパー配布会社LLC、St. によって製造 ミズーリ州ジョセフ		NDCの57319-520-05
ヒルの処方ダイエットa / d犬/猫	Hill's Pet Nutrition, Inc.、カンザス州トピカ
IOX2 ソフトウェア	EMKA Technologies、バージニア州フォールズチャー
イソフローラン、USP	Piramal Enterprise Limited、インド、アーンドラ		NDCの66794-013-25
IsoTech麻酔器	サージベット	WWV9000
ラテラルFPIデバイス	アムサイエン	302	湾曲した先端、圧力チューブ延長付き、ネジロックコネクタで接続 (Cole-Palmer; #4550-22)
ライカ A60 実体顕微鏡	Leica Biosystems、バージニア州リッチモンド	電話番号:10 450 488
マルカイン(0.5%)ブピバカインhcl注射usp 5 mg / mL	ホスピーラ、イリノイ州レイクフォレスト	CA-3627	50mL複数回投与バイアル;NDC番号 0409-1610-50
マイクロアドソン鉗子	ファインサイエンスツール	11018-12
Olsen-Hegar ニードルホルダー (縫合カッター付き)	ファインサイエンスツール	12002年14
パラコスR+G骨セメントとゲンタマイシン	ヘレウス、	参照: 5036964	ゲンタマイシン0.5g×1個を含む放射線不透過性骨セメント
ポビドンヨード溶液			ベタジン
Puralube Vet 軟膏	Dechra Veterinary Products、カンザス州オーバーランドパーク		NDCの17033-211-38
メスの刃(#10)とホルダー	インテグラミルテックス、ペンシルバニア州ヨーク	リファレンス: 4-110
メスのハンドル - #4	ファインサイエンスツール	10004-13
鎌ナイフ	ボシュ+ロムストルツ楽器	N1705 HM	5mm湾曲したブレード。丸いハンドル。全長168mm、6.6インチ。
シルバースタインマイクロミラー	ボシュ+ロムストルツ楽器	N1706 S8	直径3mm。角度は45度。全長180mm、7.2インチ
サーマル焼灼ユニット	ガイガーメディカルテクノロジー、デラスコカウンシルブラフス、アイオワ	モデル番号:150
ベチベックス	Dechra Veterinary Products、カンザス州オーバーランドパーク		獣医用pHyLyteTM注射液 pH 7.4(複数の電解質注入、タイプ1、USP)
Wistar IGSラット	チャールズ川	ひずみコード003	怪我をした時点で12週齢
ウルスタインリトラクター	ファインサイエンスツール	17018-11