凍結ラット脳組織からの単一細胞懸濁液の取得

要約

出典:Rubio, F. J., et.al. 新鮮および凍結ラット脳組織からのFos発現ニューロンの蛍光活性化細胞選別(FACS)および遺伝子発現解析。J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、酵素消化と機械的トリチュレーションを使用して、凍結ラットの脳組織を単一細胞懸濁液に解離する様子を説明しています。調製した細胞は固定され、フローサイトメトリーや遺伝子発現解析などのダウンストリームアプリケーションのためにエタノールで透過処理されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医レビューによってレビューされています。

1. ティッシュ採取前の準備

1. 遠心分離機を4^°Cに設定します。
2. 各サンプルについて、直径が約1.3、0.8、および0.4mm減少する3つのガラスパスツールピペットのセットをファイヤーポリッシュします。
3. 1 mLの冷たいバッファーAを含むラベル付きの1.7 mLチューブを準備し、チューブを氷上に保ちます。
4. 解剖を行うための脳スライスマトリックス、へら、ガラスプレート(または逆ガラスペトリ皿)が入った製氷皿を準備します。ガラスプレートの上で2枚以上のカミソリの刃を事前に冷やし、ティッシュペーパーを使用して、ティッシュに触れるすべての器具を乾かします。
5. Enzyme溶液を室温(RT)で30分間解凍してから、組織を採取してください。

2. 組織の収集と解剖

1. 組織採取の90分前に行動学的または薬理学的治療を開始します.
   手記： 本結果として、新規環境下でのラット(試験条件)と自宅ケージ内飼育のナイーブラット(対照条件)に対して、メタンフェタミン5 mg/kgの急性腹腔内注射を行った。
2. ラットを飽和イソフルランを含むガラス製の乾燥器瓶に入れて麻酔をかけ、30〜60秒後にギロチンを使用してラットの首を切り落とします
   ハサミを使って頭の皮膚と筋肉を取り除き、頭蓋骨を露出させます。ロンゲールを使用して頭蓋骨を切り、大孔を開き、頭蓋骨の背面部分を取り除きます。ロンゲールを使用して頭蓋骨の上端に沿ってカットし、脳を露出させます。脳を傷つけないように注意してください。小さなヘラを使って、脳の下をそっとすくい、持ち上げます。脳を育て、脳が自由になるまで神経を切断します。
3. かみそりの刃を使用して組織を解剖します。
   手記：次のいずれかの方法を使用して組織サンプルを採取します:(2.3.1)新たに解剖した組織;(2.3.2)解剖後の凍結組織;または(2.3.3)凍結した脳全体から解剖された凍結組織。脳のスライスマトリックス、カミソリの刃、ガラス板は、凝縮した水が細胞の低張溶解につながる可能性があるため、解剖およびミンチのプロセス全体を通して乾燥させてください。虫眼鏡を使用して、正確な解剖を行います。
   1. 新たに解剖された組織の場合、抽出したばかりの脳を、氷上で冷やした脳スライスマトリックス(1mm間隔でカミソリの刃用のスロットがあるラットの脳型の金属型)に入れます。事前に冷却した2つ以上のかみそりの刃をスロットに挿入して、目的の脳領域を含む冠状スライスを切断します。冷やしたガラス板にカットスライスを置きます.
      注:冷やしたガラス皿で脳の関心領域を解剖します。
   2. 解剖後の凍結組織の場合、上記の2.3.1で説明したものと同様に、新たに抽出した脳のスライスから目的の脳領域を解剖します。解剖した組織をマイクロチューブに入れ、マイクロチューブを-40°Cのイソペンタンに20秒間沈めて組織を急速に凍結します。解剖した組織は、次の処理まで常に-80°Cの冷凍庫で凍結してください。
   3. 凍結組織の場合は、抽出したばかりの脳を-40°Cのイソペンタンで直ちに凍結し、-80°Cの密封袋に入れて最大6ヶ月間保存してください。
      1. 解剖の日に、凍結した脳を約-20°C(-18°C以下)に設定されたクライオスタットに約2時間置き、温度を平衡化します。
         手記：この温度では脳を簡単に切断できますが、温度がこれよりはるかに低いと、脳はもろくなりすぎて安全に切断できません。
      2. かみそりの刃を使用して、凍結した脳の1〜2mmのコロナスライスをクライオスタットで切断します。凍結条件下では、鈍い12〜16ゲージの針を使用して、これらのスライスからティッシュパンチを取得します。解剖した組織は、次の処理まで常に凍結しておきます。
   4. ミンチする前に、解剖した組織を覆うために1〜2滴のバッファーAを加えます。2枚のカミソリの刃を使用して組織から白質の大部分を取り除き、残りのトリチュレーションプロセスでニューロンが失われるのを防ぎます。凍結組織から開始する場合は、冷たいガラスプレートで組織を1分以内解凍してから、バッファーA溶液を塗布します。
   5. 冷やしたガラス板にカミソリの刃でティッシュを直交する方向にそれぞれ100回ミンチにします。ミンチするときは、かみそりの刃をガラスプレートに対して垂直に保持します.
      手記： 徹底的なミンチは、すべてのプロトコルステップにとって重要です。
   6. かみそりの刃を使用して、ミンチ組織を1mlの冷緩衝液Aが入ったマイクロ遠心チューブに移します。

3. 細胞の解離

注:次の手順すべてで、穏やかなエンドツーエンドミキシングを使用してください。ボルテックスミキサーを使用せず、セルの損傷を引き起こす気泡を避けてください。

1. サンプルチューブを110 x gで4°Cで2分間遠心分離し、上清を捨てます。解凍したばかりの冷たくしたての酵素溶液(タンパク質分解酵素の混合物を含む)1mlをマイクロチューブの内壁にゆっくりと加えます。すぐにペレット全体を吸い上げ、適度に大きい先端径のピペットで4回だけ優しく上下にピペットで動かし、ミンチティッシュペレットを分散させます。
2. ペレットが底にくっつかないようにすぐにマイクロチューブを反転させ、4^°Cで30分間エンドオーバーエンド混合してサンプルをインキュベートします。
3. 酵素組織消化後、チューブを960 x gで2分間、4°Cで遠心分離します。上清を取り除き、0.6 mLの冷たいバッファーAを加えます。バッファーAを添加した直後に、同じピペットチップを使用して、ペレット全体を吸い上げ、5回ピペットで静かに上下させます。
4. 消化された組織を機械的に粉砕し、次の手順を使用して15 mLチューブに収集します。各サンプルについて、ラテックス球に取り付けられた直径が約1.3、0.8、および0.4 mmのファイヤーポリッシュガラスパスツールピペット3本の別々のセットを使用します。
   1. 1.3 mmガラスピペットで各サンプルを10回静かに粉砕します。サンプルを氷上に2分間沈殿させます(破片と未解離細胞は底に沈殿します)。上清(~0.6ml)を採取し、15mlの円錐管(チューブ#1)に移します。
   2. 残りのペレットに0.6 mLの緩衝液A溶液を加えます。0.8 mmガラスピペットでサンプルを10回回転させます。サンプルを氷上で2分間静めます。上清(~0.6ml)を採取し、同じ15mlのコニカルチューブ#1に移します。
   3. 残りのペレットに0.6 mLの緩衝液A溶液を加えます。0.4 mmガラスピペットでサンプルを10回回転させます。サンプルを氷上で2分間静めます。上清(~0.6 ml;解離していない細胞でペレットに触れずに)を収集し、同じ15 mlの円錐管#1.
      に移します 手記：直径0.4mmのピペットをチューブ#1に保管して、次のトリチュレーションステップを行います。
   4. 最小のガラスピペット(~直径0.4 mm)を使用して手順3.4.3をさらに3回繰り返し、上清を別の15 mlの円錐管(チューブ#2)に集めます。
   5. 0.4 mmガラスピペットを使用して、チューブ#1および#2に収集した細胞懸濁液をさらに10回粉砕し、氷上に保ちます。

4. 細胞の固定と透過化

1. 100%冷たいエタノール(使用前に-20^°Cで保存)を800μl加えて、サンプルごとに4本のマイクロチューブ(チューブ#1の細胞に2本、チューブ#2の細胞に2本)を調製し、氷上に保ちます。注:最終的なエタノール濃度は50%になります。
2. 細胞懸濁液 (チューブ#1およびチューブ#2から) を、冷たいエタノールが入った4本のチューブのそれぞれに~800 μlをピペットで注入し、チューブを反転させてサンプルを混合します。
3. チューブを氷上で15分間インキュベートし、5分ごとにチューブを反転させます。
4. 固定/透過処理後、チューブを1,700 x gで4°C、4分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞の損失を防ぐために50μlの溶液を残します.
   手記：この段階のペレットは白色で、透過化前よりもチューブの壁に付着しにくくなっています。そのため、ペレットがないマイクロチューブの壁面に触れるようにして上澄み液を丁寧に取り除き、マイクロピペットを使ってゆっくりと上澄み汁を吸い上げます。

5. 細胞のろ過

1. 次のように、ステップ4.4のペレットを冷たいPBSで再懸濁します。
   1. チューブ#1から採取した2本のマイクロチューブのうちの1本に550μlの冷たいPBSを加え、適度な直径のピペットチップを使用して、細胞懸濁液を5回上下に静かにピペットします。チューブ#2から来る1つのマイクロチューブについても同じことを繰り返します。
   2. チューブ#1の細胞については、同じピペットを使用して、最初の細胞懸濁液を2番目のペレットに移します。結合した細胞懸濁液を5回上下に穏やかにピペッティングして、2番目のペレットを再懸濁します。
   3. チューブ#2の細胞については、5.1.2で説明されているように、ペレット(すなわち、3番目と4番目のマイクロチューブ)を再懸濁して組み合わせます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
脳マトリックス	セルポイント・サイエンティフィック	69-2160-1	冠状脳スライスを取得するには
ハイバネートA低蛍光	ブレインビット	HA-LF	プロトコールのバッファーA'は、解離から固定ステップまでの組織および細胞の処理に使用されます
アキュターゼ	ミリポア	SCR005	プロトコールの「酵素溶液」は、トリチュレーション前の組織の酵素消化に使用されます
セルストレーナー、40 μm	BDファルコン	352340	細胞懸濁液をフィルタリングするには
セルストレーナー、100 μm	BDファルコン	352360	細胞懸濁液をフィルタリングするには
ファルコン 5ml 丸底ポリスチレン試験管 セルストレーナースナップキャップ付き	BDバイオサイエンス	352235	フローサイトメーターを通過する前に細胞懸濁液をろ過する
パスツールピペット、ガラス	NIHサプライ	6640-00-782-6008	組織トリチュレーションを行うには