我々は、そうでなければ標準的な実験の逆転写反応でmRNAの単一セルの量からcDNA収量を増加させるための新しい方法を説明します。目新しさは、ボルテックスまたは粉砕、揺れよりも効果的にマイクロリットルスケールでの流体を混合するために、音響microstreamingの現象を利用したマイクロミキサーの使用に存在する。
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方法論記事
アコースティックMicrostreamingを使用して標準的な実験系逆転写反応でmRNAの単セルの物理量からcDNA収量を増加させる
この記事について
サマリー
要約
細胞の挙動との相関遺伝子発現は、理想的には単一細胞レベルで行われます。それが転写を逆にすることができます前に、単セル（1-5 1 - 50pgのトータルRNAの％、または0.01 - 2.5pg mRNAは、セル1あたり）に存在する不安定なmRNAの少量がほとんど劣化するため、これは容易に達成されていません安定したcDNAコピーに。例えば、標準的な実験用試薬とハードウェアを使用して、遺伝子のわずかな数は、定性的にセル2ごとに評価することができます。 mRNAの単セルの量を構成する標準的な実験の逆転写酵素（RT）反応（マイクロリットルの量で、すなわち標準試薬）の効率を向上させる一つの方法は、それが低下する前にmRNAをcDNAに変換できるので、より迅速に試薬を混合することです。しかし、マイクロリットルスケールでの液体の流れが層流であるため、これは自明ではない、すなわち混合の現在利用可能なメソッド（、揺れボルテックスと粉砕つまりは）効果的に試薬を混合するために十分なカオス運動を生成するために失敗する。この問題を解決するために、マイクロスケールの混合技術は、3,4を使用する必要があります。マイクロ流体ベースのミキシング技術の数が正常にRT反応の収量5-8を増加させるが開発されている。しかし、マイクロ流体技術は、比較的高価であり、まだ広く利用できない特殊なハードウェアを必要とする。安く、より便利なソリューションが望まれる。本研究の主な目的は、mRNAの単セルの量を構成する標準的な実験RT反応の小説"マイクロミキシング"技術の応用が著しく、そのcDNA収量を増加させる方法を説明することです。遺伝子発現の解析（2）より多くの定量;（1）セルごとに分析される遺伝子の大きい数と発現量の低い遺伝子の（3）良好な検出：我々は、cDNAの収量が可能な約10 100倍、増加見つける単一細胞インチマイクロミキシングは音響は、9-12小障害物の周りに伝播する音波が障害物の近くに平均流を作る現象をmicrostreamingに基づいています。我々は、主要な簡素化と音響microstreamingベースのデバイスを（"マイクロミキサー"）を開発しました。音響microstreamingは、システムが湾曲13の小さな半径を持つ液体-空気界面を持って確保することによってオーディオ周波数で達成することができます。チューブ内の溶液のマイクロリットルの容積のメニスカスの曲率の適切な小さい半径を提供します。オーディオ周波数の使用は、ハードウェアが安価と13の多彩なことができる、と彼らは標準的な実験室sonicatorsとすることができるように、核酸と他の生化学試薬が破損していないことを意味します。
プロトコル
1。 RT反応をマイクロミキシング
- マイクロミキシングを持つRT反応を行う前に、RT反応の所望の温度にマイクロミキサーを平衡化します。
- 37内部のマイクロミキサーを置く° C（またはRTの供給業者が推奨する温度）RT反応の開始前に少なくとも1時間のためのインキュベーター。
- 入力のトータルRNA（例えば0.1-1pg/μl）、代わりにNG -μgの単一セルの金額を使用することを除いて、逆転写酵素の供給業者の（Promega社から例えばMMTV - RT、キアゲンからOmniscript）の指示にしたがってRTミックスを、設定するサプライヤーが推奨する量。
- 我々は標準的な滅菌ヌクレアーゼフリー200μL薄壁PCRチューブを使用してください。
- 彼らはミキシングの準備ができているとすぐに安全にマイクロミキサーに位置RTチューブ。マイクロミキサーは、RT反応の間、37℃のインキュベーターの内部に残るはず。
- マイクロミキシングの適切な周波数と振幅を選択します。この例では150Hzの使用。
- のマイクロミキサーを切り替えて、RT反応（60分）期間中、常にそれを残す。
- マイクロミキサーのスイッチをオフにし、RT反応が完了すると、RTのチューブを取り出します。
- 氷上でRTのチューブをセットし、そのような定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量PCRまたはリアルタイムPCR）として、さらにアプリケーションで通常どおり進みます。
2。代表的な結果：
RT反応のコンテキスト内でマイクロミキシングの利点は、他の混合方法（例えば、揺れボルテックスまたは粉砕）が使用されている場合に相対的cDNAの収量の増加です。これは、cDNAを用いて定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量PCRまたはリアルタイムPCR）のその後の分析により、例えば、見ることができます。図2Aは、直前のRTのインキュベーション（黒、"粉砕"にRT反応の粉砕に比べて最初の5分（青、"micromixed5"）または全体の60分間マイクロミキシングの効果（赤、"micromixed60"）を示しています）。この場合、前述のRT反応液量は25μlのであり、それはトータルRNAの2.5pg含まれている。 cDNAを表すNurr - 1 mRNAを検出するように設計されたプライマーを用いて定量PCRのトレースは、上記の表示され、平均値±この同じ実験の3反復で50％の最大蛍光に達するまでのサイクル数のSEMのは、以下にプロットされます。アスタリスクは、統計学的有意差（Tukeyの多重比較で、一方向ANOVA）を表します。粉砕に比べて大きな改善をもたらした前述のRT反応の最初の5分間マイクロミキシングは、前述のRT反応の全体の60分間マイクロミキシングのに対し、粉砕を介して非有意な改善をもたらしたことに注意すること、の大きさは約15定量PCRと同等であったサイクル、平均で。
マイクロミキシングのメリットも得、その後の定量PCR産物の融解曲線分析で見ることができます。図2Bに示す実験では、前述のRT反応の全体の60分間マイクロミキシングにのみ生産された最初の5分または粉砕のために一貫性のない定量PCRをマイクロミキシングのに対し、重複して試料中の一貫性のある定量PCRのシグナル（図2BA、2赤のトレース）となりましたトレース（図2BA、2青色のトレースと2本の黒い痕跡、それぞれ）。グレーのトレースは、定量PCRの反応から除外されたcDNAをしたネガティブコントロール（"NEG。"）です。この実験から、定量PCRの製品が（すなわち融解曲線分析）、その温度をランプによって変性されたそれは、適切なPCR産物（すなわち、mRNAのはるかに高い濃度が逆転写と定量PCRによって増幅された際に得られたものと同一であったアンプリコン、ことは明らかでしたデータは示されていないが）のみ60分（図2BB、2赤のトレース）のためにmicromixedされていた以下のRT反応存在していた。他のすべて（すなわちmicromixed5、粉砕およびネガティブコントロール）（例えばプライマーダイマー）の代替アンプリコンの製品を生成した。
図1標準的な実験RT反応へのマイクロミキシングを適用するためのプロトコルのフロー図。物理的原理に関与、マイクロミキサーとどのように社内のマイクロミキサーを構築するためのより詳しい説明を参照13,14に記載されています
図2。そうでなければ標準的な実験RT反応でmRNAの単一セルの量を構成するRT反応の前に適用されるマイクロミキシングのメリットを示す代表的な定量PCRデータ。Nurr - 1遺伝子をコードするcDNA表すmRNAを検出する定量PCRのトレースの例。前述のRT反応は、25μlの体積のトータルRNAの2.5pg含有し、℃で60分間、37℃インキュベーター中で行った。 RT反応は、Rの粉砕によって混合し、Tは、インキュベーション（黒痕跡、"粉砕"）する前に混ぜてRT反応の最初の5分間の間にmicromixed（青トレース、"micromixed5"）またはRT反応（赤いトレース、"micromixed60"の全体の60分間micromixed ）。平均±最大蛍光50％に達するために必要な定量PCRのサイクル数のSEMのは、この実験のn = 3の繰り返しのために以下にプロットされます。アスタリスクは有意差（Tukeyの多重比較を一元配置ANOVA）を示します。Bは Nurr - 1のcDNA産物、25μlの体積で、 トータルRNAの25pgを含むRT反応は、次のこの時間を調べるもう一つの定量PCR実験。定量PCRのトレース（）と同様に得られる定量PCR産物の融解曲線解析は（b）の異なる混合条件として使用されています。ないcDNAは前述のRT反応に含まれていないれたネガティブコントロールも（灰色の痕跡、"NEG。"）が含まれています。 mRNAのはるかに高い濃度でRT反応も行うと（b）micromixed60用（赤のトレース）の試料のものと同一の融解曲線のピークを（データは示さず）を製造した。
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ディスカッション
ここで説明する標準的な実験RT反応にマイクロミキシングのアプリケーションの方法は、もちろん、どのような方法（例えば、細胞溶解、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション）を経由して収穫されたmRNAを含むことができる。また、任意のブランドまたはRT試薬、任意の温度（マイクロミキサーの材料の許容範囲内）の種類、および任意の期間を含むことができる。例えば、我々は、ランダムヘキサマーまたはオリゴdTプライマーを構成するRT反応から改善されたcDNA収量を観察している。それは次の制約に適合する他の生化学的変換（例えば、DNAのハイブリダイゼーション15）にも適用される場合があります。現在の技術の主な制約は、反応が湾曲した液体 - 空気界面（例えばメニスカス）を形成するソリューションの小さな（マイクロリットル）ドロップ内で発生する必要があります。我々は日常的に、それぞれ、4.7以上6.9ミリメートルの曲率半径で半月板を生産する、200μL薄壁PCRチューブに10または25μlのボリュームを使用してください。これにより、異なるソリューション間のインタフェースを延長し、短いタイムスケール上の場所を取る拡散をできるドロップで設定す...
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開示事項
著者らは、開示することは何もない。
謝辞
この研究はオーストラリアの国立保健医療研究評議会（プロジェクトの助成金がない。6288480）とスコビーとクレアマッキノントラストによってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント（省略可能） |
| トータルRNAは、スナップ凍結急性準備成体マウスの脳スライスから単離された | |||
| PicoPure RNAアイソレーションキット | アークトゥルス、CA、アメリカ合衆国 | KIT0204 | キットは現在、アプライドバイオシステムズから入手できます。 |
| DNA -フリーDNase処理と除去試薬 | アンビオン | AM1906M | |
| ランダムヘキサマープライマー | プロメガ | C1181 | |
| AMV - RT | プロメガ | M5101 | |
| dNTPのセット | プロメガ | U1240 | |
| RNasin リボヌクレアーゼ阻害剤 | プロメガ | N2111 | |
| Nuclease - Free Waterを | プロメガ | P1193 | |
| SYBR グリーンPCRマスターミックス | アプライドバイオシステム | 4309155 | |
| HPRT前進（20mer）：CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| HPRTリバース（20mer）：TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1フォワード（23mer）：CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1リバース（23mer）：GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| 光度計1000分光光度計。 | サーモサイエンティフィック | ||
| コルベットローター遺伝子のRG - 6000 | コルベットライフサイエンス | コルベットライフサイエンスは、2008年7月にQIAGENに買収された |
参考文献
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