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$$\longrightharp{xx}$$,
1。 RT反応をマイクロミキシング
- マイクロミキシングを持つRT反応を行う前に、RT反応の所望の温度にマイクロミキサーを平衡化します。
- 37内部のマイクロミキサーを置く° C（またはRTの供給業者が推奨する温度）RT反応の開始前に少なくとも1時間のためのインキュベーター。
- 入力のトータルRNA（例えば0.1-1pg/μl）、代わりにNG -μgの単一セルの金額を使用することを除いて、逆転写酵素の供給業者の（Promega社から例えばMMTV - RT、キアゲンからOmniscript）の指示にしたがってRTミックスを、設定するサプライヤーが推奨する量。
- 我々は標準的な滅菌ヌクレアーゼフリー200μL薄壁PCRチューブを使用してください。
- 彼らはミキシングの準備ができているとすぐに安全にマイクロミキサーに位置RTチューブ。マイクロミキサーは、RT反応の間、37℃のインキュベーターの内部に残るはず。
- マイクロミキシングの適切な周波数と振幅を選択します。この例では150Hzの使用。
- のマイクロミキサーを切り替えて、RT反応（60分）期間中、常にそれを残す。
- マイクロミキサーのスイッチをオフにし、RT反応が完了すると、RTのチューブを取り出します。
- 氷上でRTのチューブをセットし、そのような定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量PCRまたはリアルタイムPCR）として、さらにアプリケーションで通常どおり進みます。
2。代表的な結果：
RT反応のコンテキスト内でマイクロミキシングの利点は、他の混合方法（例えば、揺れボルテックスまたは粉砕）が使用されている場合に相対的cDNAの収量の増加です。これは、cDNAを用いて定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量PCRまたはリアルタイムPCR）のその後の分析により、例えば、見ることができます。図2Aは、直前のRTのインキュベーション（黒、"粉砕"にRT反応の粉砕に比べて最初の5分（青、"micromixed5"）または全体の60分間マイクロミキシングの効果（赤、"micromixed60"）を示しています）。この場合、前述のRT反応液量は25μlのであり、それはトータルRNAの2.5pg含まれている。 cDNAを表すNurr - 1 mRNAを検出するように設計されたプライマーを用いて定量PCRのトレースは、上記の表示され、平均値±この同じ実験の3反復で50％の最大蛍光に達するまでのサイクル数のSEMのは、以下にプロットされます。アスタリスクは、統計学的有意差（Tukeyの多重比較で、一方向ANOVA）を表します。粉砕に比べて大きな改善をもたらした前述のRT反応の最初の5分間マイクロミキシングは、前述のRT反応の全体の60分間マイクロミキシングのに対し、粉砕を介して非有意な改善をもたらしたことに注意すること、の大きさは約15定量PCRと同等であったサイクル、平均で。
マイクロミキシングのメリットも得、その後の定量PCR産物の融解曲線分析で見ることができます。図2Bに示す実験では、前述のRT反応の全体の60分間マイクロミキシングにのみ生産された最初の5分または粉砕のために一貫性のない定量PCRをマイクロミキシングのに対し、重複して試料中の一貫性のある定量PCRのシグナル（図2BA、2赤のトレース）となりましたトレース（図2BA、2青色のトレースと2本の黒い痕跡、それぞれ）。グレーのトレースは、定量PCRの反応から除外されたcDNAをしたネガティブコントロール（"NEG。"）です。この実験から、定量PCRの製品が（すなわち融解曲線分析）、その温度をランプによって変性されたそれは、適切なPCR産物（すなわち、mRNAのはるかに高い濃度が逆転写と定量PCRによって増幅された際に得られたものと同一であったアンプリコン、ことは明らかでしたデータは示されていないが）のみ60分（図2BB、2赤のトレース）のためにmicromixedされていた以下のRT反応存在していた。他のすべて（すなわちmicromixed5、粉砕およびネガティブコントロール）（例えばプライマーダイマー）の代替アンプリコンの製品を生成した。
図1標準的な実験RT反応へのマイクロミキシングを適用するためのプロトコルのフロー図。物理的原理に関与、マイクロミキサーとどのように社内のマイクロミキサーを構築するためのより詳しい説明を参照13,14に記載されています
図2。そうでなければ標準的な実験RT反応でmRNAの単一セルの量を構成するRT反応の前に適用されるマイクロミキシングのメリットを示す代表的な定量PCRデータ。Nurr - 1遺伝子をコードするcDNA表すmRNAを検出する定量PCRのトレースの例。前述のRT反応は、25μlの体積のトータルRNAの2.5pg含有し、℃で60分間、37℃インキュベーター中で行った。 RT反応は、Rの粉砕によって混合し、Tは、インキュベーション（黒痕跡、"粉砕"）する前に混ぜてRT反応の最初の5分間の間にmicromixed（青トレース、"micromixed5"）またはRT反応（赤いトレース、"micromixed60"の全体の60分間micromixed ）。平均±最大蛍光50％に達するために必要な定量PCRのサイクル数のSEMのは、この実験のn = 3の繰り返しのために以下にプロットされます。アスタリスクは有意差（Tukeyの多重比較を一元配置ANOVA）を示します。Bは Nurr - 1のcDNA産物、25μlの体積で、 トータルRNAの25pgを含むRT反応は、次のこの時間を調べるもう一つの定量PCR実験。定量PCRのトレース（）と同様に得られる定量PCR産物の融解曲線解析は（b）の異なる混合条件として使用されています。ないcDNAは前述のRT反応に含まれていないれたネガティブコントロールも（灰色の痕跡、"NEG。"）が含まれています。 mRNAのはるかに高い濃度でRT反応も行うと（b）micromixed60用（赤のトレース）の試料のものと同一の融解曲線のピークを（データは示さず）を製造した。