マウス脳組織由来細胞膜タンパク質のパルミトイル化状態の評価

要約

出典:Speca、D. J.、他。脳膜タンパク質のパルミトイル化の定量的測定のためのアシル-PEGyl交換ゲルシフトアッセイ。J. Vis. Exp. (2020年).

このビデオは、マウスの脳組織から単離された細胞膜タンパク質のパルミトイル化状態の解析を示しています。このプロセスでは、非パルミトイル化システインを露出させてブロックし、次にパルミトイル化システインに結合するポリマーを使用して、単離されたタンパク質のパルミトイル化状態の評価を支援します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. マウス脳膜の調製

1. ギロチン装置を使用してマウスの首を切り、脳を迅速に解剖します(可能であれば、解剖手順中に発生する可能性のあるパルミトイル化の変化を最小限に抑えるために、可能であれば<1分で)。氷上のガラス製ホモジナイザー(~12ストローク)で、10 mLの均質化緩衝液(表1)で直ちに均質化します。
2. ライセートを1,400 x g、4°Cで15分間遠心分離し、上清を氷上の新しいチューブに移します。ペレットを等量の均質化バッファーに再懸濁(~6ストローク)し、710 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
3. ステップ1.2の上清を混合し、40,000 x gで4°Cで20分間遠心分離します。
4. 上清(細胞質画分)を捨て、ペレット化した膜(P2)画分を均質化緩衝液に再懸濁します.
   手記：サンプルは急速冷凍し、後で使用するために-80°Cで保存できます。
5. ビシンコニン酸(BCA)アッセイを実施して、タンパク質レベルを定量します。Acyl-PEGyl Exchange Gel-shift(APEGS)アッセイでは、1.5 mLチューブ中のバッファーA(表1)の容量470 μLに~100-200 mgのタンパク質(最大250 mg)を注入することから始めます。超音波処理を行い、>13,000 x gで25°Cで10分間遠心分離し、不溶性タンパク質を除去します。可溶化したタンパク質を新しい1.5 mLチューブに移します。

2. アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイ

1. ジスルフィド結合を破壊し、遊離システインをブロックします。
   1. 25 mM トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP; 25 μL、ストック溶液から添加)でインキュベートすることにより、ジスルフィド結合を破壊します。表1)55°Cで60分間
   。
   2. 50 mM N-エチルマレイミド (NEM; 12.5 μL, ストック溶液から添加;表1)室温で3時間
      手記：反応は一晩で延長することができます。
2. クロロホルムメタノール(CM)沈殿を行います。
   1. タンパク質溶液を1.5 mLチューブからポリプロピレンまたはガラスチューブに移し、スイングバケットローターで適度な速度で遠心分離できます。5mLのチューブが理想的です。4容量(2 mL)のメタノール(MeOH)を加え、短時間ボルテックスします。
   2. 2容量(1 mL)のクロロホルムとボルテックスを短時間加えます。
   3. 3容量(1.5 mL)の脱イオン水(dH₂O)を加え、短時間ボルテックスします。
   4. スイングバケットローターでサンプルを3,000 x g、25°Cで30分間遠心分離します。
   5. 上相を慎重に取り外して廃棄します。
   6. 3容量(1.5mL)のMeOHを加え、不透明なタンパク質パンケーキを断片化しないように注意しながら、穏やかに、しかし十分に混合します。
   7. スイングバケットローターで3,000 x g、25°C、10分間遠心分離します。
   8. ガラス血清ピペットを使用して、タンパク質パンケーキを乱さずにトップフェーズをできるだけ多く取り除きます。
   9. ペレットを1mLのMeOHで慎重にすすいでください。
   10. ペレットを少なくとも10分間風乾します.
       手記：乾燥ペレットは-20°Cで保存できます。
3. パルミトイル-チオエステル結合とヒドロキシルアミン(NH₂OH、HAM)の切断を行います。
   1. タンパク質沈殿物を125μLのバッファーAに再懸濁し、短時間超音波処理します。>13,000 x gで25°Cで10分間遠心分離し、不溶性物質を除去します。可溶化したタンパク質を新しい1.5 mLチューブに移します。
   2. 375 μL のバッファー H (HAM+;表1)またはバッファT(HAM-;表1)に添加し、サンプルを25°Cで60分間インキュベートします。
4. 手順 2.2.
   で説明した CM 沈殿を繰り返します 手記：乾燥ペレットは-20°Cで保存できます。
5. 保護されていないシステインにmPEGを添加します。
   1. ペレットを10 mM TCEPを含むバッファーA100 μLに再懸濁します。1.5 mLチューブに移します.
      手記：CMの沈殿ステップ中にタンパク質の大幅な損失が発生したのは正常です。その後のすべてのステップは 1.5 mL チューブで実行され、タンパク質の量が最大 120 ~ 130 μL に制限されます。これにより、最終的なCM沈殿中のタンパク質損失が減少します。
   2. 20 mM mPEG-5k (25 μL、ストック溶液から添加;表1)タンパク質サンプルにピペッティングで混合する。エンドオーバーエンド回転させながら、25°Cで60分間インキュベートします。
   3. 未取り込まれたmPEG-5kを除去するには、ステップ2.2で説明したように、4容量のMeOH(500 μL)、2容量のクロロホルム(250 μL)、および3容量のdH₂O(375 μL)の調整容量を使用してCM沈殿を行います。>13,000 x gで25°Cで10分間遠心分離します。
   4. 前と同じように上相を慎重に取り除き、厚くて綿密なパンケーキを避けます。MeOH1mLを加え、穏やかに、しかし十分に混ぜます。>13,000 x gで25°Cで10分間遠心分離します。
   5. 上清を慎重に取り除き、ペレットを1mLのMeOHですすいでください。>13,000 x gで25°Cで10分間遠心分離します><。 手記：乾燥ペレットは-20°Cで保存できます。
   6. 乾燥させたペレットを50 μLのバッファーA(TCEPまたは還元剤を含まない)に再懸濁します。

結果

表1:APEGSアッセイに使用した溶液。 均質化バッファーとバッファーAは事前に準備できます。ただし、使用直前にプロテアーゼ阻害剤とフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)を添加してください。他のすべての溶液は新鮮に調製する必要があります。

バッファ	コンポーネント	ワーキングコンク。	コメント
均一化	0.32 M スクロース、1 mM トリス pH 7.2、1 mM MgCl2		使用直前に...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヒドロキシルアミン (HAM)	サーモフィッシャー	26103
メトキシPEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)	ノフ	ME-050MA	MW ~5000 kDa
マイクロフュージ	エッペンドルフ	5415R	または同等の機器
N-エチルマレミド (NEM)	カルバイオケム	34115	毒性が高い
デンシトメトリー用光学イメージャー	Azure Biosystems	サファイア生体分子イメージャー	または同等の機器
キャップ付きポリプロピレンチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-956-1D
セロロジカルピペット(ガラス)	フィッシャーサイエンティフィック	13-678-27D
卓上遠心分離機	ベックマン	アレグラ X-15R	または同等の機器
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)	EMDミリポア	580560