アルツハイマー病モデリングのためのアミロイドβ放出ポリマーマイクロビーズの作製

要約

出典:Almari, B., et al. アルツハイマー病のモデリングに使用するためのアミロイドβ分泌アルギン酸マイクロビーズの製造。 J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、神経毒性のあるアミロイドβ分泌細胞をカプセル化するポリマーマイクロビーズの作製方法を紹介しています。細胞-ポリマー懸濁液はマイクロビーズ製造装置で処理され、カルシウム架橋によってポリマーゲル化が達成され、細胞の周囲に球状のマイクロビーズが形成されます。このポリマーは、細胞増殖を可能にすると同時に、制御された長期のアミロイドベータ放出を可能にし、アルツハイマー病におけるその蓄積をシミュレートします。

プロトコル

1. 事前準備

1. 100 mL の ~4% (w/v) アルギン酸原液を調製します。
   1. 4.4 gのアルギン酸ナトリウム塩を秤量し、乾燥粉末を100 mLのHEPES緩衝生理食塩水(HBS、20 mMヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸[HEPES](0.477 g)と150 mM NaCl(0.877 g)の脱イオン水に加えて、水分補給を行います。
   2. マグネチックスターラーを~500回転/分(rpm)で使用し、50°Cまで加熱してアルギン酸塩を完全に水和させます
      手記：アルギン酸塩が完全に水和するのに1〜2時間かかる場合があります。時間を節約するために、アルギン酸溶液はカプセル化プロトコルの1日前に調製し、翌日まで4°Cで保存することができます。アルギン酸塩を冷蔵した場合は、ウォーターバスまたはホットプレートで37°Cまで穏やかに加熱し、使用直前にマグネチックスターラーで撹拌します。
   3. 使用前に、0.22μmの細孔ポリエーテルスルホン(PES)フィルターを使用してアルギン酸溶液を滅菌ろ過します。アルギン酸塩の流れを容易にするために、37°Cでのろ過が推奨されます。温度が下がると粘度が上がります。
2. 0.5 M CaCl₂ 1,000 mL を調製します。
   1. 55.49 g の無水 CaCl₂ を秤量し、1,000 mL の HBS (1,000 mL の脱イオン水に 20 mM HEPES および 150 mM NaCl) に溶解します。
   2. 0.22μmのポアPESフィルターを使用した滅菌フィルター。
3. 100mLの溶解ミックスを調製します。
   1. リン酸緩衝生理食塩水に100 mM HEPES(23.83 g)および500 mMクエン酸三ナトリウム二水和物(147.05 g)溶液を調製します。
   2. NaOHまたはHClを使用してpH 7.4に調整します。

2. カプセル化システムの設定

1. 層流フードを清掃します。
   1. カプセル化器を含む層流フードをUV露光を使用して滅菌し、その後70%v / vエタノール溶液を噴霧します。
   2. 封止器システムを10 mLの70% v / vエタノール溶液で洗い流し、続いて10 mLの滅菌脱イオン水
   で洗い流します。
   3. 300μmのノズルを取り付け、手順2.1.2を繰り返します。
   4. ろ過されたアルギン酸溶液が入ったボトル、ろ過された塩化カルシウム溶液が入ったボトル、および70% v / vエタノール溶液で使用されるツール、機器、空の培養プレートにスプレーし、それらを層流フードに入れます。使用する前に、UVライトを再度30分間オンにして、完全に滅菌してください。
   5. 生物学的グレードの消毒液で満たされた廃棄物ビーカーを準備し、ビーカーをフードに入れます。
   6. ビーカーに100mLの滅菌CaCl₂(水溶液)を入れ、マグネチックスターラーを加えます。攪拌速度を100rpmに設定します。ビーカーをノズルの先端から18cmの高さにある磁気プラットフォームに置きます。このビーカーは、アルギン酸ビーズを収集し、それらのゲル化を可能にするために使用されます。
2. カプセル化用の細胞を準備します。
   1. インキュベーターから細胞を取り出し、0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液を使用してコンフルエントに近いフラスコから分離し、37°Cで5〜10分間インキュベー
   トします。
   2. 細胞密度を推定するためにサンプルを分離し、残りの細胞を1,000rpmで5分間遠心分離して細胞ペレットを取得します。
   3. ペレットをHBS(20 mM HEPESおよび150 mM NaCl)に再懸濁して、最終的な所望の細胞濃度を2倍にします(例:最終濃度が1.5 x 10⁶細胞/mLの場合、HBSで細胞を再懸濁して3 x 10⁶細胞/mLの濃度を達成します)。
   4. 50 mLの遠心チューブで、細胞懸濁液を~4%(w/v)アルギン酸溶液と1:1の比率で混合し、~2%(w/v)アルギン酸溶液中に所望の細胞濃度(例:1.5 x 10⁶細胞/mL)を含む最終懸濁液を得ます。
3. カプセル化パラメータを設定します。
   1. 封止機の速度を最大押出速度(8.9mL/min)、電圧を1.0kV、周波数を5,500Hzに設定します
      手記：これらのパラメータは、直径550μmのマイクロビーズを得るために以前に最適化されていました。

3. 製造

1. マイクロビーズを作製します。
   1. 20 mLシリンジに5 mLの細胞アルギン酸懸濁液をロードし、シリンジをカプセル化器に取り付けます。
   2. 細胞アルギン酸懸濁液をフィーダーに押し込む流れを活性化して、封止器を始動します。液滴の流れがノズルから押し出されます。
   3. 最初の1 mLを廃棄物ビーカーに集めて、最初の不均一な流れを避けます。
   4. 残りの4 mLを泳動し続け、液滴をCaCl₂ゲル化槽に落下させます。各ミリリットルは別々に(ただし連続して)実行でき、必要に応じて4つの異なるゲル化浴に収集できます
      手記： ゲル化浴と接触すると、液滴中のアルギン酸塩はゲル化浴中のカルシウムイオンと即座に架橋し、球状のマイクロビーズを形成します。
   5. 1分後、ゲル化ビーカーを磁気プラットフォームから取り外し、マイクロビーズを攪拌せずにさらに4分間放置します(室温でマイクロビーズを完全にゲル化するために必要な時間)。
2. マイクロビーズを取得します。
   1. 滅菌ピンセットを使用して大きなアルギン酸塩の破片やアーティファクトを取り除き、滅菌プラスチックピペットを使用して74 μmメッシュフィルターに移し、ゲル化槽からマイクロビーズを回収します。
   2. 適切な培地を使用してマイクロビーズを遠心分離チューブに移し、細胞培養培地中で5分間平衡化します。
   3. フラスコ、プレート、またはシャーレに移して、インキュベーションやさらなる実験を行います
      手記：ゲル化浴は再利用しないでください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 um PESフィルター	メルク(英国)	SLGP033RS
15mmネットウェルインサート74umメッシュフィルター	Constar, アメリカ	#3477
褐藻類からのアルギン酸ナトリウム塩	Sigma-Aldrich、英国	A0682 さん
塩化カルシウム	Sigma-Aldrich、英国	C1016
CellTiter96 AQueous One Solution細胞増殖アッセイ	Promega, アメリカ	G3580
カプセル化器	イノテック	IE-50	シリアル番号 05.002.01-2005
ヘープス	Sigma-Aldrich、英国	H4024-J
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich、英国	D1408
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich、英国	433209
クエン酸トリスジウム二水和物	Sigma-Aldrich、英国	W302600-K
トリプシン-EDTA溶液	Sigma-Aldrich、英国	T4049

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