一酸化窒素阻害剤を用いたマウスモデルにおける白質脳卒中誘発

要約

出典:Nunez, S., et al. 軸索変性および白質神経生物学の研究のための皮質下白質脳卒中の多用途マウスモデル。J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、麻酔をかけたマウスに、白質内の標的脳座標に一酸化窒素阻害剤を注入することにより、白質脳卒中を誘発する正確な技術を示しています。これにより、血管が収縮し、血液供給が阻害され、ニューロンの損傷や脳卒中を引き起こします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医レビューによってレビューされています

注: まず、対象となるマウスの個体数を特定します。これまでの研究では、雄の野生型C57/Bl6マウスのみを用いています。しかしながら、種々のトランスジェニックマウスまたはノックアウトマウスも使用することができる。定位座標はC57/Bl6の解剖学的構造に基づいていることに注意してください。各ユーザーは、最初にストロークの白質への局在を確認することをお勧めします。

1.White Matter Stroke Induction - 内側角度アプローチ

1. まず、遠位径が15〜25μmの0.5mmキャピラリーチューブを使用して、プルガラスピペットを準備します。
2. L-Nio (N(5)-(1)-イミノエチル-L-オルニチン塩酸塩) を滅菌0.9%生理食塩水溶液中で27.4 mg/ml (130 μM) の滅菌10 μLアリコートを調製します。
3. 真空ラインに接続されたチューブにガラスピペットを固定することにより、引っ張ったガラスピペットに少量のL-Nio(2〜5μl)を事前に充填します。ピペットをベンチトップに平らに置き、引っ張った端をL-Nio溶液に挿入します。
   1. ピペットの0.5mm部分のうち少なくとも2mmが満たされるまで真空を適用します。バキュームをオフにし、ピペットを引き出します。ステップ1.12まで脇に置いておきます。
4. マウスを誘導チャンバーに置き、気化器(5L/分の酸素と0.5L/分の窒素で5L/minを吸入)に流した標準的な32%イソフルランを使用して、マウスの麻酔を1分間または深く麻酔するまで麻酔を誘発します。マウスを定位顕微鏡を備えた定位装置に移します。気化器(2 L / minの酸素と0.5L / minの窒素を吸入)とノーズコーンを流れる32%イソフルランを使用して維持麻酔を提供します。つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。
5. インジェクションアームを36°に調整します。
6. 引っ張ったガラスピペットホルダーを低容量圧力注入システムの遠位端に取り付け、定位セットアップの注入アームに取り付けます。
7. 麻酔をかけた動物のひげにワセリンを塗り、人工涙液軟膏を両目に置きます。動物の頭に滅菌ドレープを置き、頭の上に5〜10 cmの開口部を設けて、滅菌手術野を準備します。頭蓋骨を覆う毛皮を剃ることにより、無菌手術用表面を準備します。ベタジンと70%アルコールスワブを交互に使用して頭皮を洗浄します。
8. 頭蓋骨の表面を露出させるために、滅菌された細いハサミで1.5cmの正中線の頭皮切開を行います。滅菌綿棒で頭蓋骨を乾燥させ、1〜3倍の倍率で定位顕微鏡を使用して、滅菌マイクロポイントツールを使用して上にある骨膜組織を取り除きます。
9. 細いポイントマーカーを使用して、Bregmaを参照ポイントとしてマークします。
10. Bregmaの後方から開始し、正中線のすぐ左前方に伸びる滅菌細片外科用ドリルビットを使用して、2mmの楕円形開頭術をドリルします。骨片とその上にある軟部組織を取り除き、大脳皮質を視覚化できるようにします。
11. 滅菌生理食塩水を断続的に滴下することにより、術野と皮質表面を湿らせてください。
12. 引っ張ったガラスピペットを定位装置のインジェクターアームに取り付けます。ピペットの遠位端をBregmaに合わせ、定位座標をゼロにします。
13. ピペットを表1に記載されている最初の前/後(A / P)および内側/外側(M / L)座標に進めます。
14. ピペットを皮質表面まで進め、背側/腹側(D / V)測定値をゼロにします。
15. Table 1の最初のD/V座標に到達するまで、ピペットをゆっくりと脳に通します。
16. 20 psi に設定された低容量圧力注入システムを 20 ミリ秒パルスで使用し、100 nl の L-Nio を脳に注入し、ピペット トラックの逆流を防ぐために 5 分間待ちます。
    1. 定位顕微鏡の接眼レンズにキャリブレーションされたレチクルを使用し、倍率を3倍にします。
    2. したがって、座標のセットごとに、引っ張られたガラスピペットから合計0.100 mm³(直径0.5 mmのピペットで0.5 mmの長さ、100 nlに相当)を変位させます。レチクルを使用して、使用する倍率やスケールによって各セットアップが異なるため、測定と標準化を行います。
    3. 各注入中に正確な容量測定を行うには、角度付きピペットに顕微鏡を横から近づけて、空気流体メニスカスが矢状から見えるようにします。メニスカスは、ピペットの内壁と外壁の両方の同じ焦点面に現れる必要があります。
17. ピペットをゆっくりと引き出し、表1に記載されている2番目と3番目の座標セットで手順1.13〜1.16.3を繰り返します。
18. 最終注射後、ピペットを取り外し、開頭術部位を埋めるのに十分な骨ワックスを置きます。頭皮の傷口の端を近似し、皮膚接着剤で結合します。
19. 滅菌済みの30G針を使用して0.1mlの0.5%マルカインを創傷縁に注入し、頭皮切開に伴う局所的な痛みを防ぎます。
20. 動物を家に戻し、術後の抗生物質(0.48 mg / mlトリメトプリムスルファメトキサゾールまたは0.5 mg / mlレボフロキサシン)を飲料水に5日間供給します。.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
L-N5-(1-イミノエチル)オルニチン、二塩酸塩	カルバイオケム	400600-20MG
イソフルラン	フェニックス・ファーマシューティカル社	NDC 57319-559-06
キャピラリーチューブ	ワールド精密機器	50-821-807
ピコスプリッツァー	パーカー計装	ピコスプリッツァーII
定位設定	ケント・サイエンティフィック	KSC51725
ピペットプーラー	コップフ	モデル720
実体顕微鏡 SZ51	オリンパス	88-124
細いハサミ	ファインサイエンティフィックツール	14084-08
鉗子	ハーバード大学装置	PY2 72-8547
湾曲鉗子	ハーバード・デバイス	PY2 72-8598
鈍器解剖ツール	ファインサイエンティフィックツール	10066-15
ドリル	ドレメル	8220-1/28
ドリルビット	ファインサイエンティフィックツール	19007-05
ベトボンド	3M	1469SB
マルケイン	ホスピーラ	NDC 0409-1610-50
トリメトプリム-スルファメタキソール	STI薬局	NDC 54879-007-16