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方法論記事
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2025年7月8日
出典:Wang, S., et al.近接ライゲーションアッセイを用いた、ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部におけるIn situタンパク質間複合体の検出。J. Vis. Exp. (2015).
このビデオでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)を使用して、ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)でのタンパク質間相互作用の可視化を示しています。体壁を単離した後、相互作用するタンパク質を一次抗体とPLA標識二次抗体でプローブします。相互作用するタンパク質が近接しているため、コネクターオリゴヌクレオチドによるプローブのライゲーションが促進され、環状DNAが形成され、ローリングサークル増幅によって増幅されます。蛍光プローブは増幅されたDNAに結合し、NMJでのタンパク質間相互作用の可視化を可能にします。
1. 体壁の準備
注:第3幼虫の体壁の準備(体壁の筋肉を神経支配するNMJの研究用)は、前述のように行われましたが、いくつかの変更が加えられました。
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図1:3番目の幼虫の体壁の準備。(A-F) 体壁の解剖を表す概略図。 (A) 1匹の幼虫をシルガード円板に置き、その背側を上にして2つの気管路が見えるようにします。(B) 幼虫の前端と後端を細かいピンで留めます。 その過程で幼虫を縦に伸ばします。(C) 幼虫の体の背側に3つの切開をします。切開が完了すると、「I」のようになるはずです。 (D) 幼虫の体を広げて角を固定し、その過程で体壁を水平方向と垂直方向に伸ばして均等に張力のかかった長方形を形成します。(E) 残っている内臓をすべて掃除します。(F) 体壁の角を切って遺伝子型を区別するさまざまな方法の例を示しています。(G) <.......
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 鉗子(細かい#5) | アルメディック | A10-704 | |
| シルガードディスク | 世界の精密機器 | SYLG184 | エラストマーベースと硬化剤を10:1の比率で混合します。30分に設定します。型に注ぎます(例:12ウェル細胞培養プレートを使用します)。少なくとも24時間硬化させてください。解剖するときは、60x15mmのシャーレ蓋に接着してください。 |
| 微細ピン(先端径0.0125mm) | ファインサイエンスツール | 26002-10 | |
| マイクロダイセクションハサミ(超極細) | ファインサイエンスツール | 15200から00 | |
| プラットフォームスライド | 22x22mmのカバースリップ2枚を透明なマニキュアで顕微鏡スライドに接着し、間に<20mmの隙間を空けてサンプルを取り付けます。 | ||
| W1118 | ブルーミントンショウジョウバエストックセンター | 3605 | |
| HTS01103 | ブルーミントンショウジョウバエストックセンター | 10989 | ストックはGFPバランサー上で再バランスされ、GFPシグナルの不在に基づいてホモ接合変異体を選択できるようになりました。 |
| 1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水):3mM NaH2PO4、7mM Na2HPO4、130mM NaCl、pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1)、Na2HPO4 (Caledon - 8120-1)、NaCl (Caledon - 7560-1) | ||
| Bouinのソリューション | シグマ・アルドリッチ | HT10132 | |
| 4% PFA(パラホルムアルデヒド):1x PBS中の4% PFA | PFA(アナケミアサイエンス - 66194-300)。解決策の作り方については、doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006を参照してください。 | ||
| 1x PBT(リン酸緩衝生理食塩水とトリトン):1x PBS、0.01%トリトン | トリトンX-100(シグマ・アルドリッチ-T8787) | ||
| 1% BSA(ウシ血清アルブミン):1x PBT中の1% BSA | BSA(バイオショップカナダ - ALB001)。4°Cで保存してください。 | ||
| マウスアンチDLG(ディスク大) | Developmental Studies Hybridoma Bank (発達研究ハイブリドーマバンク | 4F3 | 1% BSAで1:10の希釈度で使用してください。 |
| ウサギ抗HtsM(Hu-li tai shao) | Lynn Cooley博士(イェール大学)によって提供されました。1% BSAで1:250の希釈度で使用してください。 | ||
| ウサギ抗Pak(p21活性化キナーゼ) | ニコラス・ハーデン博士(サイモンフレーザー大学)によって提供されました。1% BSAで1:500の希釈度で使用してください。 | ||
| マウス対Wg(翼なし) | Developmental Studies Hybridoma Bank (発達研究ハイブリドーマバンク | 4D4 | 1% BSAで1:5希釈して使用してください。 |
| ヤギ抗HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ) | ジャクソン免疫研究 | 〒123-065-021 | 1% BSAで1:200の希釈度で使用してください。 |
| FITC標識ロバ抗ヤギ | ジャクソン免疫研究 | 〒705-095-003 | 1% BSAで1:200の希釈度で使用してください。 |
| Duolink In Situ PLA プローブ アンチマウス MINUS | シグマ・アルドリッチ | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA プローブ 抗ウサギ PLUS | シグマ・アルドリッチ | DUO92002 | |
| Duolink In Situ 検出試薬 レッド | シグマ・アルドリッチ | DUO92008 | |
| 1 x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | シグマ・アルドリッチ | DUO82049 | Tris(Caledon Laboratories - 8980-1)、NaCl(Caledon - 7560-1)、Tween 20(Fisher Scientific - BP337) |
| 1 x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5 (1 x 洗浄バッファー B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5 | シグマ・アルドリッチ | DUO82049 | トリス(Caledon Laboratories - 8980-1)、NaCl(Caledon - 7560-1) |
| 0.01x 洗浄バッファー B: 2mM Tris、1mM NaCl、pH 7.5 | シグマ・アルドリッチ | DUO82049 | トリス(Caledon Laboratories - 8980-1)、NaCl(Caledon - 7560-1) |
| Duolink In Situ 埋込剤 (DAPI付き | シグマ・アルドリッチ | DUO82040 |
