近接ライゲーションアッセイを用いたショウジョウバエ幼虫のタンパク質間相互作用の検出

要約

出典:Wang, S., et al.近接ライゲーションアッセイを用いた、ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部におけるIn situタンパク質間複合体の検出。J. Vis. Exp. (2015).

このビデオでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)を使用して、ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)でのタンパク質間相互作用の可視化を示しています。体壁を単離した後、相互作用するタンパク質を一次抗体とPLA標識二次抗体でプローブします。相互作用するタンパク質が近接しているため、コネクターオリゴヌクレオチドによるプローブのライゲーションが促進され、環状DNAが形成され、ローリングサークル増幅によって増幅されます。蛍光プローブは増幅されたDNAに結合し、NMJでのタンパク質間相互作用の可視化を可能にします。

プロトコル

1. 体壁の準備

注:第3幼虫の体壁の準備(体壁の筋肉を神経支配するNMJの研究用)は、前述のように行われましたが、いくつかの変更が加えられました。

1. 解剖
   1. フライストックとクロスを25°Cで5〜6日間、標準的な手順で飼育します。
   2. 細い鉗子を使用して、バイアルまたはボトルから這う3番目の幼虫を選びます。
   3. リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)が入った小さなシャーレで幼虫を洗い、食物粒子を取り除きます。
   4. 1匹の幼虫をシルガードディスクに置き、氷のように冷たいPBSを数滴浸します。氷のように冷たいPBSを使用すると、幼虫を気絶させるのに役立ち、操作が容易になります。解剖全体を通して、調製物が乾燥するのを防ぐために、調製物が常にPBSに浸されていることを確認してください。
   5. 幼虫の背側を上にして配置し、2つの気管路が解剖顕微鏡で見えるようにします(図1A)。鉗子を使用して微細なピンをつかみ、気門の後端で幼虫をピン留めします(図1B)。別のピンで、口のフック近くの前端にあるキューティクルに穴を開けます。幼虫をゆっくりと縦に伸ばし、固定します(図1B)。
   6. マイクロダイセクションハサミを使用して、ピンの近くの後端をつまんで小さな開口部を作ります。切開部は、キューティクルを通過するのに十分なほど表面的である必要があります。
   7. はさみの底刃の先端を切開部に配置し、2つの気管路の間の背側正中線の全長に沿って切り込みます(図1C)。切断するときは、腹側体壁の筋肉を損傷しないように、はさみの刃を少し上に向けてください。
   8. 後方に配置されたピンの少し前方に小さな水平切開を行います(図1C)。前方に配置されたピンの少し後方に別の同様の切開を行います(図1C)。切開部はキューティクルを通過する必要があります.
      手記：ステップ1.1.7と1.1.8の3つの切開を合わせると、""のようになるはずです。つまり、幼虫の体の背側に左右のフラップが生成されるはずです。
   9. 鉗子で内臓を丁寧にきれいにします。PBSを数滴強力に追加すると、臓器が幼虫の体から移動し、臓器を簡単に取り除くことができます。幼虫の体を突くと、体壁の筋肉に損傷を与えるため、避けてください。
   10. 幼虫の体を広げて開き、角を固定します(図1D)。ピン留めするときは、体壁を水平と垂直の両方に伸ばして、均等に張力がかかった長方形を形成します(形状については図1Gを参照)、その過程で体壁の筋肉を引き裂かないように注意してください。
   11. 残っている内臓の除去を終了します(図1E)。
2. 固定と透過化
   1. ピンで固定された体壁をBouin's Solutionの数滴に浸します。氷上で15分間インキュベートします。あるいは、代替の固定剤として4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用してください。30分間インキュベートします。
   2. リン酸緩衝生理食塩水とトリトン(PBT)で3回すすぎます。
   3. 細い鉗子を使用して、ピンを慎重に取り外し、体壁の角をシリコン処理した0.65mlの微量遠心チューブに移します。
   4. PLAの準備ができるまで、体壁を4°CのPBTで保管します。最適な結果を得るには、解剖後1日か2日以内に体壁の免疫染色を開始してください.
      手記：試薬を節約し、アッセイ中にすべての体壁が等しく処理されるようにするために、異なる遺伝子型を1本のチューブに入れることができます。遺伝子型は、体壁の角を異なる方法で切断することで区別できます(たとえば、図1Fを参照)。

2. 免疫組織化学

注:3番目の幼虫の体壁の免疫染色は、前述のように行われましたが、いくつかの変更を加えました。
手記：すべてのステップは、特に明記されていない限り、室温で穏やかに攪拌して行ってください。

1. ブロッキング
   1. 体壁をPBTで3回、それぞれ10分間洗浄します。
   2. 1% ウシ血清アルブミン (BSA) で 1 時間ブロックします。
2. 免疫染色
   1. 目的の2つのタンパク質に対するマウスおよびウサギの一次抗体(1% BSAで希釈)と体壁を室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。この場合は、1:10マウスの抗Dlg(Dlg=円板大)と1:250のウサギの抗HtsM(HtsM:Hu-li tai shao mutant)を使用します。マウスまたはウサギで作られていないマーカーに対する抗体も含めることができます - 例えば、1:200ヤギ抗Hrp(Hrp=西洋ワサビペルオキシダーゼ)を使用してニューロン膜を描写します。
   2. PBTで3回、各10分間洗浄します。
   3. 蛍光色素標識二次抗体とインキュベートして、マーカー(1% BSAで希釈)を室温で2時間、または4°Cで一晩検出します。PLAシグナルは後で赤色蛍光色素で可視化されるため、マーカーを検出するために別の蛍光色素を使用する必要があります(例えば、1:200フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識抗ヤギ抗体を検出するには、1:200フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識抗ヤギ抗体を使用します。感光性試薬を使用しているため、この時点から先はチューブを暗くしてください.
      手記：このキットを使用すると、マウスで産生した一次抗体とウサギで産生した一次抗体の間でPLAを行い、共焦点顕微鏡で赤チャンネルにシグナルを可視化することができます。必要に応じて、他の動物種で産生された一次抗体を用いてアッセイを行い、シグナルを他のチャネルで可視化することを可能にする他のキットもご用意しています。

3. 近接ライゲーションアッセイ

注:特に明記されていない限り、すべてのステップを室温で穏やかに攪拌して実行してください。

1. PLAプローブ
   1. 体壁をPBTで3回、それぞれ10分間洗浄します。
   2. PLAプローブ(1% BSAでそれぞれ1:5希釈)と37°Cで2時間インキュベートします。この場合、40 μlのPLAプローブanti-mouse MINUS、40 μlのPLA probe anti-rabbit PLUS、120 μlの1% BSAを使用して、5〜10個の体壁に適切な浸漬と混合を確保します。PLAプローブを最大1:25に希釈しても、適切なS/N比が得られます(つまり、この実験の場合)。
2. 結紮
   1. 体壁をウォッシュバッファーAで5分間ずつ2回洗浄します。
   2. ライゲーション溶液(ライゲーションバッファー中のリガーゼを1:40に希釈)と37°Cで1時間インキュベートします。この場合、5 μlのLigase、40 μlの5 Ligationバッファー、155 μlの高純度水を使用して、5-10の体壁を適切に浸漬し、混合します。
3. 増幅
   1. 体壁をウォッシュバッファーAで2回、各2分間洗浄します。
   2. 増幅溶液(増幅バッファー中のポリメラーゼの1:80希釈)と37°Cで2時間インキュベートします。この場合、2.5 μlのポリメラーゼ、40 μlの5 Amplificationバッファー、157.5 μlの高純度水を使用して、5〜10の体壁を適切に浸漬および混合します。
4. イメージングの準備
   1. 体壁をウォッシュバッファーBで2回、それぞれ10分間洗浄します。
   2. 0.01x Wash Buffer Bで1回、1分間洗浄してください。
   3. マウントする前に、数滴のマウント溶液で少なくとも30分間平衡化するか、4°Cで一晩保存してください。
   4. 細い鉗子を使用して、体壁をキューティクルを下に向けてプラットフォームスライドに慎重に移します。ボディウォールを一列に並べ、同じ向きで1滴または2滴のマウンタント内に配置します。気泡が発生しないように注意しながら、22 mm x 40 mmのカバースリップを製剤の上に置き、スライドを透明なマニキュアで密封します。
   5. スライドは、共焦点イメージングの準備が整うまで、-20°Cの暗所で保管します。

結果

図1:3番目の幼虫の体壁の準備。(A-F) 体壁の解剖を表す概略図。 (A) 1匹の幼虫をシルガード円板に置き、その背側を上にして2つの気管路が見えるようにします。(B) 幼虫の前端と後端を細かいピンで留めます。 その過程で幼虫を縦に伸ばします。(C) 幼虫の体の背側に3つの切開をします。切開が完了すると、「I」のようになるはずです。 (D) 幼虫の体を広げて角を固定し、その過程で体壁を水平方向と垂直方向に伸ばして均等に張力のかかった長方形を形成します。(E) 残っている内臓をすべて掃除します。(F) 体壁の角を切って遺伝子型を区別するさまざまな方法の例を示しています。(G) <...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
鉗子(細かい#5)	アルメディック	A10-704
シルガードディスク	世界の精密機器	SYLG184	エラストマーベースと硬化剤を10:1の比率で混合します。30分に設定します。型に注ぎます(例:12ウェル細胞培養プレートを使用します)。少なくとも24時間硬化させてください。解剖するときは、60x15mmのシャーレ蓋に接着してください。
微細ピン(先端径0.0125mm)	ファインサイエンスツール	26002-10
マイクロダイセクションハサミ(超極細)	ファインサイエンスツール	15200から00
プラットフォームスライド			22x22mmのカバースリップ2枚を透明なマニキュアで顕微鏡スライドに接着し、間に<20mmの隙間を空けてサンプルを取り付けます。
W1118	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	3605
HTS01103	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	10989	ストックはGFPバランサー上で再バランスされ、GFPシグナルの不在に基づいてホモ接合変異体を選択できるようになりました。
1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水):3mM NaH2PO4、7mM Na2HPO4、130mM NaCl、pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1)、Na2HPO4 (Caledon - 8120-1)、NaCl (Caledon - 7560-1)
Bouinのソリューション	シグマ・アルドリッチ	HT10132
4% PFA(パラホルムアルデヒド):1x PBS中の4% PFA			PFA(アナケミアサイエンス - 66194-300)。解決策の作り方については、doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006を参照してください。
1x PBT(リン酸緩衝生理食塩水とトリトン):1x PBS、0.01%トリトン			トリトンX-100(シグマ・アルドリッチ-T8787)
1% BSA(ウシ血清アルブミン):1x PBT中の1% BSA			BSA(バイオショップカナダ - ALB001)。4°Cで保存してください。
マウスアンチDLG(ディスク大)	Developmental Studies Hybridoma Bank (発達研究ハイブリドーマバンク	4F3	1% BSAで1:10の希釈度で使用してください。
ウサギ抗HtsM(Hu-li tai shao)			Lynn Cooley博士(イェール大学)によって提供されました。1% BSAで1:250の希釈度で使用してください。
ウサギ抗Pak(p21活性化キナーゼ)			ニコラス・ハーデン博士(サイモンフレーザー大学)によって提供されました。1% BSAで1:500の希釈度で使用してください。
マウス対Wg(翼なし)	Developmental Studies Hybridoma Bank (発達研究ハイブリドーマバンク	4D4	1% BSAで1:5希釈して使用してください。
ヤギ抗HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)	ジャクソン免疫研究	〒123-065-021	1% BSAで1:200の希釈度で使用してください。
FITC標識ロバ抗ヤギ	ジャクソン免疫研究	〒705-095-003	1% BSAで1:200の希釈度で使用してください。
Duolink In Situ PLA プローブ アンチマウス MINUS	シグマ・アルドリッチ	DUO92004
Duolink In Situ PLA プローブ 抗ウサギ PLUS	シグマ・アルドリッチ	DUO92002
Duolink In Situ 検出試薬 レッド	シグマ・アルドリッチ	DUO92008
1 x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4	シグマ・アルドリッチ	DUO82049	Tris(Caledon Laboratories - 8980-1)、NaCl(Caledon - 7560-1)、Tween 20(Fisher Scientific - BP337)
1 x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5 (1 x 洗浄バッファー B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5	シグマ・アルドリッチ	DUO82049	トリス(Caledon Laboratories - 8980-1)、NaCl(Caledon - 7560-1)
0.01x 洗浄バッファー B: 2mM Tris、1mM NaCl、pH 7.5	シグマ・アルドリッチ	DUO82049	トリス(Caledon Laboratories - 8980-1)、NaCl(Caledon - 7560-1)
Duolink In Situ 埋込剤 (DAPI付き	シグマ・アルドリッチ	DUO82040