単離されたミトコンドリアのカルシウム保持能力の決定

要約

出典:Li, W., et. al. Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオは、ミトコンドリアがカルシウムを吸収する際の蛍光のリアルタイムな変化を監視することにより、ミトコンドリアのカルシウム保持能力を評価する手順を示しています。このアッセイは、ミトコンドリアの機能や、アポトーシスや神経変性疾患などのカルシウム関連プロセスの研究に役立ちます。

プロトコル

1. ミトコンドリア^Ca2+保持容量の決定

1. KCl培地(125 mM KCl(塩化カリウム)、2 mM K₂HPO₄(リン酸二カリウム)、1 mM MgCl₂(塩化マグネシウム)、20 mM HEPES(2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸)、5 mMグルタミン酸、5 mMリンゴ酸、および2 μMロテノン、pH 7.4)を調製し、実験前にCa²⁺結合緑色蛍光色素を最終濃度0.5 μMまで添加します。
2. 0.5 μM Ca²⁺結合緑色蛍光色素を含むKCl培地中の単離ミトコンドリア1 mL(0.4 mg/mL)を各6ウェルプレートウェルに移します。
3. ミトコンドリアとCa²⁺結合性緑色蛍光色素を室温で6ウェルプレートでインキュベートし、周囲光から1分間保護し、20 mM CaCl₂(塩化カルシウム)溶液(20 mM CaCl₂、127 mM KCl、1 mM MgCl_2、20 mM HEPES、5 mMグルタミン酸)の4 μLアリコートを加えます。 5 mM リンゴ酸、pH 7.4) を自動分注設定を使用して各 6 ウェルプレートウェルに 200 nmol Ca²⁺/mg ミトコンドリアタンパク質を導入します。
4. 蛍光分光器を使用して、励起波長506 nm、発光波長531 nmで3秒ごとに2分間蛍光変化を監視します。プレートには、ソフトウェアによって制御される読み取り値間で600rpmで3秒間の振とうが装備されています(図1)。
5. 各ウェルに20 mM CaCl₂溶液の4 μLアリコートを追加し、蛍光の変化を3秒ごとに2分間モニターします。蛍光が時間とともに増加するまで、この手順を繰り返します。
   手記： ミトコンドリアは、記録蛍光の増加によって示されるCa²⁺の添加によって挑戦されます。mPTP(ミトコンドリア透過性遷移孔)が開くと、時間とともに蛍光が増加します。
6. mPTP が開くまでに加算された Ca²⁺ の合計量を Ca²⁺ 保持容量と解釈します。

結果

図1:ミトコンドリアCa²⁺保持容量アッセイのソフトウェア設定。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カルシウムグリーン-5N	ライフテクノロジーズ	C-3737	カルシウム結合性緑色蛍光色素
グルタミン酸	シグマ・アルドリッチ	RES5063G-A7
マラテ	シグマ・アルドリッチ	46940-U
ロテノン	シグマ・アルドリッチ	R8875
HEPESさん	シグマ・アルドリッチ	H3375
塩化マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	457
リン酸二カリウム	シグマ・アルドリッチ	V900050
KCl	シグマ・アルドリッチ	P9541
塩化カルシウム	シグマ・アルドリッチ	V900266