マウス脳への持続薬物注入が末梢血糖値に及ぼす影響の評価

要約

出典:Ajoy, R., et. al.マウス脳への持続薬物注入システムによる視床下部インスリンシグナルの末梢グルコース不耐症の研究。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、マウスの脳への継続的な薬物注入が血糖値に及ぼす影響を示しています。グルコース代謝は、絶食したマウスの尾から血液を採取し、経口グルコース投与の前後のグルコースレベルを測定することによって評価されます。インスリン耐性は、マウスにインスリンを注射することによって評価され、グルコースレベルは特定の間隔で記録されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 微小浸透圧ポンプ輸液システムの準備

注:ポンプ、人工脳脊髄液(aCSF)緩衝液、および薬剤(Met-CCL5/RANTESタンパク質溶液(10 ng/mL in aCSF))を0.2 μmフィルターでろ過した緩衝液を使用して無菌条件下で調製し、手袋をはめて培養フードの下ですべての手順を実施します。手術手順は次のように行われます。

1. 手術の1日前に微小浸透圧ポンプを準備します:キットに付属の1mLの注射器と鈍頭針を使用して、脳の微小浸透圧ポンプに人工脳脊髄液(aCSF)を満たします。微小浸透圧ポンプをaCSFに浸し、シェーカーに載せて一晩穏やかに振< /> 注意: ポンプにはCSFを充填し、ポンプ内部に気泡が入らないようにする必要があります(図1A)。
2. 手術を開始する前に、実験用の組換えMet-CCL5/RANTESタンパク質溶液(10 ng/mL、aCSFで希釈)を準備します。ポンプからaCSFを取り出し、余分なものが漏れるまでゆっくりとポンプに薬液を入れます
   注:5〜8ポンプには15mLのaCSFまたはMet-CCL5/RANTES溶液で十分です
   注意: 手順を繰り返して、ポンプが内部に気泡のない薬剤で完全に満たされていることを確認します。.
3. カテーテルチューブを希望の長さにカットし、脳注入キットの鈍い先端の脳注入針に取り付けます。輸液キットとチューブに薬を入れます。
4. 最後に、脳輸液キットを組み立てて微小浸透圧ポンプに取り付けます.
   注意: チューブやポンプに気泡が発生しないようにしてください(図1A)。
5. aCSFにセットした浸透圧ポンプ-脳融合体全体を滅菌した50mLチューブに浸し、ポンプの乾燥を防ぎます。浸透圧ポンプと脳の融合セットは、手術に使用する準備が整いました.
   注:微小浸透圧ポンプシステムは、長期の薬物注入に使用できます。これにより、マウスの脳への安全で便利な薬物送達が可能になります。

2. 脳内心室手術 – 微小浸透圧ポンプの埋め込み

注意:手術環境を75%エタノールで滅菌し、研究に関与する人々が滅菌手袋と清潔な白衣を着用していることを確認してください。手術器具/器具は、使用前にオートクレーブ滅菌して乾燥させ、その後、マウスの手術の合間に75%エタノールで滅菌する必要があります。

1. マウスの体重を量り、ケタミン/キシラジン(ケタミン50 mg / kg、キシラジン10 mg / kg).
   注意:マウスの体重が24g未満のマウスは、浸透圧ポンプ移植手術には推奨されません。
2. マウスヘッドを定位装置に取り付けて固定します(図1B)。
3. 外科用ハサミとペンチを使用して、頭蓋骨を覆っている外側の皮膚を切り開きます。ヨウ素を使用して、周囲の頭蓋骨を清掃します。
4. 浸透圧ポンプ脳融合セットの移植のために、首の領域近くの一対の鈍い頭のはさみの助けを借りて、皮膚の最外層を皮下皮膚から分離します(図1C)。
5. 定位装置を使用して、脳マップ(図1D)を参照して注入ポイントをマークします。この実験では、針を第 3 心室領域 (Bregma: 横方向 0.0 mm、後方 1.3 mm、腹側 5.7 mm) に埋め込む必要があります。
6. 頭蓋骨にマークされた領域の周りにネイルドリルを使用して穴を開けます(図1E).
   注意:マウスの髄膜や血管を壊さないように注意して、脳内の微小血管の破壊を避けてください。
7. aCSF(コントロールとして)または薬物(Met-CCL5/RANTESタンパク質溶液)を含む微小浸透圧ポンプ-脳融合セットを頸部の後ろの皮膚の下に置き、ドリルで開けた穴に脳注入針を挿入して、マウスの脳に薬物を注入します(図1E)。針は髄膜を貫通し、心室に入ります。表面減感作ジェル(図1F)を使用して針を頭蓋骨の所定の位置に固定し、接着剤が乾くまで1〜2分待ちます。次に、針の上の突出部を切り取ります(図1G-H)。
8. ティッシュ接着剤を使用して、頭の手術傷を癒します。傷口の上に50μLの接着剤を塗布し、皮膚の両側を一緒に引っ張り、皮膚が密閉されるまで30秒間保持します(図1I).
   注意:手術後の傷口の清掃には100%アルコールパッドを使用し、感染を防ぐためにストレプトマイシンを含む100ulペニシリンを使用してください。手記：マウスの皮膚は瘢痕組織を形成し、外科用接着剤の投与後数日で治癒します。接着剤の主な利点は、皮膚の炎症や炎症を引き起こす可能性のある外科的縫合を避けることです。
9. マウスを温かいプレート(37°Cまで加熱)に保たれた清潔なケージに入れ、マウスが麻酔効果から回復するまで待ちます
   注意:手術後の生存率を高めるためには、マウスの体温を維持することが重要です。
10. 1週間の回復期間の後、マウスは経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)やインスリン負荷試験(ITT)などのさらなる実験の準備が整います。

3. 経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT)

注:aCSFおよび^MetCCL5 / RANTES(10 ng / mL、100μL)の注入の7日後に経口ブドウ糖負荷試験を実施します。OGTTの前にマウスの6時間の絶食を維持し、十分な水を供給します。動物を実験が行われるのと同じ作業台に置いて、動物が環境に順応して手順中のストレスを軽減できるようにします。

1. グルコース溶液の調製:実験を行う前に、3.75gのグルコースを15mLの蒸留_H2Oに溶解してグルコース溶液を調製します。
2. 実験手順中の測定値を記録するためのタイムテーブルを設定します(表1).
   注:実験中に正確な記録を可能にするために、各血液検査の間に適切な間隔でタイムテーブルを設定することが重要です。
3. 絶食後、各マウスの体重を量り、注射するブドウ糖の適切な量を計算します。例えば、マウスの体重が30gの場合、投与するグルコース溶液の量は300μLとすべきです。
4. ワークベンチで次の機器を準備します。
   1. 血糖値計(スタートボタンを押してバッテリーの状態を確認します。テスト前に機能していることを確認してください。
   2. グルコースチップ
   3. インスリンシリンジ(0.3 mLインスリンシリンジ)
   4. カミソリの刃
   5. タイマー
5. ベンチが設置されたら、次のように血糖値を測定および記録します:清潔で新しいグルコースチップをグルコメーターに入れ、スタートボタンを押してゼロにします。
6. マウスの首の後ろをつまみ、尾を数回撫でて、尾部への十分な血流を確保します。
7. 新しいカミソリの刃を使用して尾の小さな部分を切り取り、1滴の血液(約10〜20μL)をグルコースチップに絞り出します。正確な測定を可能にするために、血液がチップを満たす必要があります。血糖値計はすぐに血糖値を表示します。マシンに「エラー」が表示された場合は、新しいグルコースチップで手順を繰り返します.
   注:グルコースチップには1滴の血液しか必要ありません。血液サンプルを複数回採取する必要がある場合は、マウスの尾に沿って指を数回動かし、尾の端をチップの真上に保持して圧力をかけるだけで採血できます。血液サンプルを採取する際に、いちいち尻尾を切る必要はありません。
8. 次に、マウスにグルコース(0.25 g / mL)を胃内強制経口投与して与えます。投与されるグルコースの量は、次の式を使用して計算する必要があります:体重(BW)μLグルコース溶液の10倍(たとえば、マウスの体重が30 gの場合、投与されるグルコース溶液の量は300μLになります)。経口ブドウ糖を投与した直後にタイマーを開始します。
9. グルコース測定手順を15分、30分、60分、90分、120分で繰り返します。
10. すべてのグルコースレベルの測定値が記録されたら、カミソリの刃とグルコースチップをバイオハザードコンテナに捨てます。餌をマウスケージに戻し、動物室に戻します。

表 1.経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)記録のタイムテーブル

名 名 名 名 名 名 名 名

#	マウス ID	体	グルコース	始める	0	15	30	60	90
		重量	μL = 10xBW	時間	分	分	分	分	分
1	501	25.8グラム	258	9:00	9:00	9:00	9:15	9:30	10:00
2	502	25.3グラム	253	9:07	9:07	9:07	9:22	9:37	10:07

結果

図 1.マウスにおける浸透圧ポンプの調製と移植手術。(A)脳輸液キットとポンプ製剤を薬液で灌流。赤い矢印は、液体で満たされたカテーテルチューブを示しています。(B)マウスヘッドを定位装置に固定して取り付けます。(C)皮膚の最外層を皮下皮膚から分離して、微小浸透圧ポンプ-脳注入セットを移植します。破線は浸透圧ポンプインプラントの位置を示します。(D)矢印は注入側を示しています。(E)頭蓋骨のマークされた領域の周りに穴を開けます。(F)浸透圧ポンプ脳注入セットをマウスの背面に置き、脳注入針をドリル穴(破線の丸で囲んだ部分)に挿入します。(G)組織接着接着剤を使用して...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Vetbondティッシュ接着剤	3メートル	#1049SB	マウスの頭部の病変部位をシールするために使用される接着剤
LOCTITE 454インスタント接着剤	株式会社デュレクト	#8670	マウスの頭蓋骨に針を固定するために使用した接着剤
Alzetマイクロ浸透圧ポンプ	株式会社デュレクト	#9922	0.11 μl/時間、28日間
脳輸液システム	株式会社デュレクト	#8851	1〜3 mm、マウスの脳に薬物を灌流するために使用されます
グルコメーター	ロシュ	#06870244001	血糖値の測定に使用
グルコースチップ	ロシュ	#06454011020	血液サンプルのロードに使用
エバンズブルー	シグマ	#MKBK0523V	薬物注入領域を実証する
インスリン注射器	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	#3232145 C	腹腔内インスリンの投与に使用されます
MIO NE116 コントロールユニット (ネイルドリル)	Mioシステム	#E235-015	マウスの頭蓋骨に穴を開けるには
CCL5/Met-RANTESタンパク質	研究開発	#ADB0111081	組換えヒトCCL5、大腸菌由来
aCSFフォーミュラ	119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mMグルコース		0.22μmのフィルター装置でフィルター滅菌し、4°C. で保存します。 aCSFは3〜4週間安定しています
リン酸化IRS-1 Serine302抗体	細胞シグナル伝達	#12879	1:1000希釈
IRS-1 (D23G12) 抗体	細胞シグナル伝達	#12879	1:1000希釈
Phospho-Akt Serine 473	細胞シグナル伝達	#9916	1:2000希釈
Akt (pan) (C67E7) 抗体	細胞シグナル伝達	#9916	1:1000希釈
動物:C57BL/6	NARラボ		研究で使用した野生型マウス系統

抗体