マウスモデルにおける虹彩角膜角閉塞による実験的緑内障誘発

要約

出典:Bunker, S., et al.磁気マイクロスフェアの眼球注射によって誘発される実験的緑内障。J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、麻酔をかけたラットが、磁場下で前房に磁気ビーズを注入して虹彩角膜の角度をブロックする眼科手術を受けています。この閉塞は、海綿網を閉塞し、房水の排出を妨げ、眼圧の上昇を引き起こし、網膜神経節細胞と視神経を損傷します。これにより、緑内障のような状態が発症します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 高眼圧症の誘発

1. Brown Norwayラットの前房に常磁性マイクロスフェアを片側注射することにより眼圧(IOP)を上昇させることにより、実験的緑内障を誘発します。他の色素沈着ラットが適しているかもしれないが、使用者は最初にそれらを検証する必要がある。
2. 250-300 gの雌の元ブリーダーであるブラウンノルウェーラットを一定の低照度環境(40-60ルクス)で飼育し、IOPの日周変動を最小限に抑え、食物と水にアクセスできます。
3. 麻酔とビーズ注射の前に、ラットの眼で使用するために校正されたリバウンド眼圧計9を使用して、覚醒している動物8でベースラインIOP測定を行います。IOPは、5つの読み取り値の平均として取得されます。
4. 腹腔内に送達された 37.5 mg/kg ケタミンと 0.25 mg/kg 塩酸メデトミジンでラットに麻酔をかけます。ポビドンヨードの塗布(ステップ1.5を参照)およびビーズ注射(ステップ1.8を参照)の前に、動物の後足反射をテストして麻酔の深さを確認します。鎮痛のために0.5%プロパラカイン塩酸塩を投与します。
   注:どの段階でも瞳孔を広げないでください。これにより、ビーズが虹彩角膜の角度によりよく落ち着き、レンズへの結合を防ぐことができます。手術を受けていない反対側の眼の角膜乾燥を防ぐために、眼軟膏を塗布します。
5. 注射の5分前に、手術眼を5%ポビドンヨードで水で洗浄します。.
6. 5分後、滅菌ガーゼを使用してポビドンヨウ素を吸い取り、0.9%滅菌生理食塩水で眼を洗います。麻酔中は、滅菌生理食塩水を定期的に塗布して目を湿らせてください。
7. 目の周りにトロイダル磁石を置きます。
8. ハンク平衡塩溶液 (HBSS) 中の 30 mg/ml のガンマ線照射滅菌済み 8 μm 磁性マイクロスフェアを含む溶液 25 μl を、33 G の斜めの針を使用して前房に注入します。
   1. ビーズを調製するには、再懸濁して洗浄し、10,000 x gで10,000 x gで5分間3回遠心分離し、1 mLのHBSSで最終的な30 mg/ml溶液を調製します。全体を通して無菌状態を維持します。
   2. 注射の場合は、虹彩の外傷のリスクを最小限に抑えるために、針を虹彩に挿入しないように注意してください。これは、針を角膜表面に接するように、虹彩とできるだけ平行に向けることで防ぐことができます。これにより、注入部位からのビーズの損失を最小限に抑えるのにも役立ちます。
      注: 虹彩角膜の角度の周囲に均一な分布を確保するために、ビーズを高速で注入します。これは IOP を上げるために重要です。また、ビーズ、針、磁気リングは別々に保管することでビーズがクラスターを形成してシリンジに装填して注入しにくくなったり、針が磁化したりしないようにします。
9. 注射後1分間針を所定の位置に置いたままにして、ビーズが虹彩角膜角に落ち着き、小柱網からの水性ドレナージを妨げることを確認します。.ビーズが最初に落ち着いた後、針をわずかに傾けて水性の漏れを許容し、IOPの一時的な増加を最小限に抑えます。手術の最後に、最初にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、次に70%エタノール、続いて蒸留水で針を洗い流し、別々の手順で針を引き続き使用できるようにします。あるいは、正しいゲージとシリンジの組み合わせが利用可能な場合は、使い捨ての針を使用することもできます。オプション:針はベベラーを使用して研ぎ、使用を延長することができます。
10. この段階で、必要に応じて磁石を取り外し、それを使用して、カバレッジが不完全な領域にビーズを引き込みます。
11. 注入後さらに10分間、磁石を目の周りに置いたままにして、ビーズが虹彩角膜の角度にしっかりと落ち着くようにします。
12. 0.25 mg/kg の塩酸アチペメゾールを使用した逆麻酔。
13. 感染を防ぐために、クロラムフェニコールまたは他の抗生物質軟膏、例えば、ゲンタマイシンまたはテラマイシンを局所的に投与し、鎮痛のために0.5%塩酸プロパラカインを投与する。動物が動きを取り戻すまでヒートマットの上で回復させ、その後、動物を暖かい箱に移し、回復が完了するまで栄養補助食品や湿らせた通常の食事などの追加の栄養を供給します。全身的または局所的な鎮痛は、手術後24時間で痛みの兆候を示す動物に投与する必要があります。.治療にもかかわらずこれらの症状が続く場合は、動物を人道的に淘汰する必要があります。
14. 対側の目を操作なしのコントロールとして使用します。
15. ビーズ投与後2〜3日ごと、その後2〜3日ごとに、ラットの眼で使用するために校正されたリバウンド眼圧計を使用して、IOP測定を行います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
250-300gの雌のブラウンノルウェー元ブリーダーラット	ハーラン イギリス	203
トノラボリバウンド眼圧計	ティオラット	TV02
ケタセット(ケタミン)	フォートドッジアニマルヘルス	BN1000118	37.5 mg/kg
ドミトール(メデトミジン塩酸塩)	オリオンファーマ	140-999	0.25 mg/kg
ポビドンヨウ素	エコラボ	BN4369LE10	H2Oで5%
ミニムの生理食塩水	ボシュロム	PL00033/5017
トロイダル磁石	スーパーマグネタイト	R-10-07-03-N
磁気マイクロスフェア	バングス研究所	UMC4N/9692
HBSSの	インビトゲン	14025
33ゲージの面取り針	ハミルトン	7747から01	カスタムニードル
ルアーチップシリンジ	ハミルトン	80601
アンチセダン(塩酸アチペメゾール)	オリオンファーマ	〒141-003	0.25 mg/kg
クロラムフェニコール軟膏	メディコム	18956-0005

名 の