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動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
スライドとティッシュ
の準備
- シラン調製スライドまたはポリエチレンナフタレート(PEN)膜ガラススライドのいずれかを使用します。
- RNA単離では、スライドをRNase除染液に浸漬し、RNaseフリー水で3回洗浄した後、段階的な一連のRNaseフリーエタノールで脱水し、30分間真空乾燥します。
- クライオスタットを使用して組織切片を厚さ10 μmで切断し、調製したRNaseフリースライドにマウントします。切片化中は、RNAの品質を保つために切片を凍結しておいてください。手記：LCMはスライドの端に近すぎる組織を除去できないため、組織がスライドの端から約4mm離れていることを確認してください。PENメンブレンスライドから組織を除去するには、組織がスライドの左側、上部、下部から4 mm、右側から7 mm(スライドに取り付けられていないメンブレンの寸法)にあることを確認します。
- 直接免疫組織化学を用いて個々の細胞集団を単離するには、組織をSilane-prepスライドまたはPENメンブレンスライドのいずれかに切片化します。間接免疫組織化学ガイド技術を用いて組織領域を単離するには、免疫組織化学用のSilane-prepスライドに1セットの切片を装着し、PENメンブレンスライドおよび/またはLCMに使用するSilane-prepスライドのいずれかに代替切片を装着します。
2.レーザーキャプチャのための組織調製 - 免疫反応性細胞の直接レーザーキャプチャのための迅速なチロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学
- 疎水性ペンで組織の輪郭を描き、乾燥させます。
- アセトン-メタノール(1:1)溶液中で-20°Cで10分間組織を固定します注:私たちの経験では、アセトン-メタノール固定は、アセトンまたはメタノール単独よりもはるかに一貫した免疫組織化学をもたらしたことが示されています。
- スライドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1%トリトン(RNaseフリー)ですすいでください。
- 100-200 μl PBSと1% Triton、チロシンヒドロキシラーゼ抗体、400 U/mL RNasinで1:100に希釈した切片を覆います。5〜10分間インキュベートします。
- PBSで2回、PBS-1%トリトンで短時間すすぎます。
- 400 U/ml RNasinおよび50 ng/ml DAPIでPBS-1% Tritonで1:100に希釈したAlexa Fluor 488で標識した100-200 μlのヤギ抗ウサギIgGで組織を覆います。5分間インキュベートします。
- PBSで2回すすぎ、次に、段階的な一連のRNaseフリーエタノール(75%-75%-95%-95%-100%-100%)で30秒間脱水します。
- キシレンを2回洗浄して1分間、続いて5分間インキュベートします。
- LCMに使用する直前にキシレンからスライドを取り出し、風乾させます。