ショウジョウバエの視細胞における膜タンパク質輸送の研究

要約

出典:Wagner, K. et al., Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-tagged Proteins. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオでは、eGFPタグ付きTRPLタンパク質を用いて、ショウジョウバエの光受容体細胞における膜タンパク質輸送を可視化する様子をご覧いただけます。イメージング用のトランスジェニックフライの調製、視細胞の蛍光画像のキャプチャ、およびラブドメアの相対的なeGFP蛍光を測定することによるTRPL輸送の定量化について詳しく説明します。

プロトコル

1. 一般的な考慮事項

1. タンパク質輸送(例:一過性受容体電位様(TRPL)イオンチャネル:: 強化緑色蛍光タンパク質(eGFP)、アレスチン2(Arr2)::eGFP))に関する分析には、永久に横紋体に位置する転座タンパク質を発現するショウジョウバエストックを使用してください。
2. 実験アプローチのために、選択したハエの光曝露条件を事前に決定します。
   1. 暗順応のためには、ハエを25°Cで所望の期間、暗い箱に入れておく。転座実験(例えば、ハエを発現するTRPL::eGFP)で16時間までの照明を行うには、ハエを室温の蛍光管の下に保管してください。
   2. 色付きの光でハエを照らすには、蛍光管と一緒にさまざまな色の透明なプラスチックボックスを使用します。

2. 水浸顕微鏡法

1. ハエの準備
   1. 図1に示すように、必要な機器と試薬を備えた作業スペースを準備します。あらかじめ決められた年齢と照明条件でハエを予冷した15mLの遠心分離管に移し、氷上で15〜30分間インキュベートして麻酔します。
      注: 1日齢の暗順適応ハエを参考にして持ち運んでください。一般的に、暗順応したハエは、暗闇の中で蓋付きのアイスボックスに移す必要があります。光に適応したハエは、室内の光の中で氷に転写することができます。
   2. 氷に麻酔をかけたフライ1匹を頭から200μLのピペットチップに移し、圧縮空気でフライを慎重にチップに向かって押します。
   3. メスを使って頭のすぐ前でピペットの先端を切り取ります。ピンセットを使用して、フライを先端から数ミリメートル慎重に押します。ピペットチップを再度切断し、フライのヘッドのみがピペットチップから突き出るように、フライを圧縮空気でチップに向かって押し戻します。
   4. プラスチックをオブジェクトのスライドに接着し、フライの左目または右目が上を向くようにピペットの先端をその中に押し込みます(図2A)。画像取得の直前に、実験室のピペットを使用して、大量の冷水滴を水浸対物レンズの下側に接着します(図2B)。最良の結果を得るには、すぐに画像取得に進んでください。
      注:画像取得の大幅な遅延により、ハエが再び目覚め、動きが生じ、画像がぼやける可能性があります。
      
2. 画像取得
   1. 準備したフライでオブジェクトスライドを顕微鏡ステージに慎重に置き、水浸対物レンズを選択します。
   2. ハエの目が水滴に触れるまで、水浸対物レンズを手動で下げます(図3A、B)。
   3. 顕微鏡UVランプのスイッチを入れ、適切なフィルターセットを選択します。接眼レンズを使用してフライを対物レンズの下に配置し、顕微鏡を目の表面に焦点を合わせます。
   4. 顕微鏡カメラへの光路を切り替え、対応するソフトウェアでライブ画像を生成します。図 3C-E で詳しく説明されているように、目が顕微鏡の対物レンズに放射状に向く必要があることを考慮して、カメラのフォーカスを再調整し、目の向きを評価します。
   5. イメージングソフトウェア内の適切なLUT(ルックアップテーブル)を使用して、過飽和(赤いピクセルで示される)を検出します。
   6. 色素沈着していないハエの場合は、最も明るいピクセルがすべての画像の彩度制限のすぐ下になるように露光時間を調整します。
   7. 画像を記録し、RAWファイルとして保存して、記録の対応するすべてのメタデータをアーカイブします。次の定量化のために、画像を.tif形式でエクスポートします。
      注: 画像取得直後にハエを赤色光 (例: 630 nm) で 5 分間照らします。これは、ハエがさらなる実験に使用することを意図している場合です。赤色光は、画像取得中に強い短波光によって過剰に活性化された光伝達カスケードを不活性化します。
      
3. 水浸顕微鏡写真の横紋体における相対eGFP蛍光のデータ分析と定量
   1. ソフトウェアImageJ/Fijiをダウンロード、インストール、実行します。
   2. ImageJの設定を調整するには、Analyze>Set Measurements...を選択し、Mean Gray Value のチェックボックスのみにチェックを入れます。.tif画像をインポートするには、[ファイルを開く]>をクリックします。またはドラッグ&ドロップで。ピントが合っている画像の代表的な領域を選択し、Ctrl と+を同時に繰り返し押して、200%〜300%に拡大します。
   3. Oval ツールを選択し、Shift キーを押しながら、蛍光ラブドーム1個よりも大幅に小さい円形の選択範囲を画像内に生成します。マウスボタンを離す前に、ImageJ メインウィンドウのツールバーの下に表示されている正確なサイズを確認してください。すべての解析で同じサイズの円形選択を使用します。
      注: 円形選択範囲の正確なサイズ (ピクセル単位またはミクロン単位) は、特定の設定によって異なります。1日齢の暗順適応したコントロールフライの横紋径の約1/3または1/4の円を使用します。
   4. 円形の選択範囲を移動するには、マウスでクリックしてドラッグするか、キーボードの矢印キーを押します。
   5. 円形選択内の蛍光強度を測定するには、円を最初の横紋体(r1)に移動し、Analyze > Measureをクリックするか、ショートカットCtrl + Mを使用します。Result ウィンドウが開き、測定された灰色の値が一覧表示されます。
   6. 繰り返し測定としてr2-r6の測定を続け、バックグラウンド信号の測定を行います(b)。色素沈着していないハエの場合は、対応する細胞体領域(c1-c6)を追加で測定します(図4)。
   7. 手順 2.3.5 と 2.3.6 を繰り返して、さらに 2 つの ommatidia を行い、3 回のテクニカル レプリケートを行います。Pencilツールを使用して分析されたommatidiaをマークし、この画像をドキュメント用に保存します。
   8. 結果ウィンドウから測定されたグレー値を選択してコピーし、スプレッドシートソフトウェアに貼り付けてさらに計算します。蛍光強度の値を、その起源に従って、ラブドメア(r)、細胞体(c)、およびバックグラウンド(b)のカテゴリに分類します。各カテゴリ(Ir、Ic、Ib)から平均強度を計算します。
   9. ラブドームに存在するeGFPの相対量を計算します。
   10. 手順 2.3.3 の次の画像に進みます。信頼性の高い測定を得るためには、各実験グループの少なくとも5人の個人からの画像を生物学的複製として使用することをお勧めします。

結果

Figure 1: 水浸顕微鏡ワークスペース 必要な材料: (A) 15 mL 遠心チューブ、(B) アイスフレーク、(C) 冷蒸留水、(D) 実体顕微鏡、(E) ペトリ皿、(F) 粘土、(G) オブジェクトスライド、 (H

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL 遠心チューブ	Greiner Bio-One	188271	Flystuff	59-172
冷灯ランプ (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
紫外線ランプ、カメラ、フィルターセット、ソフトウェアを備えた蛍光顕微鏡 (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)	< td style='border-left-style:none;border-top-style:none;'>
蛍光管	Osram	4050300518039.00
ラボ用ピペット (20-200 μL)	Eppendorf
Object slide	Roth	656.1
ピペットチップ (200 μL)	Labsolute	7695844
Plasticine (Blu-Tack)	Bostik	30811745
Stereo microscope (SMZ445)	Nikon
UVランプ、カメラ、ファイラーセット、ソフトウェア(MZ16F、MC170 HD、GFP3、LAS 4.12)を備えた実体顕微鏡	Leica

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