神経変性タンパク質の過剰発現を伴う酵母細胞におけるヒストン修飾の検出

要約

出典:Bennett, S. A., et al., 酵母神経変性タンパク質症モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特徴付け.J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、神経変性タンパク質を過剰発現する酵母細胞のヒストン修飾を評価する手順を示しています。ステップには、細胞溶解、遠心分離、電気泳動、膜転写、および修飾ヒストンの抗体ベースの検出が含まれます。

プロトコル

1. ヒストンの翻訳後修飾

1. を検出するための細胞溶解とウェスタンブロッティングCell lysis
   1. 酵母細胞ペレットを氷上で解凍し、細胞ペレットを100μLのdH₂Oに再懸濁します。
   2. 細胞の再懸濁液に、0.2 M NaOHを300 μL、2-メルカプトエタノールを20 μL加えてください。ピペッティングで上下させて再懸濁します。
   3. 氷上で細胞を10分間インキュベートし、その後、3,200 x gの卓上遠心分離機でRTで30秒間遠心分離します。上清を捨てます。
   4. 細胞ペレットを1xローディング染料100μLに再懸濁し、加熱ブロックで10分間煮沸します。
      注：6倍ローディング染料のレシピは、材料の表にあります。
2. ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動および膜転写
   1. ゲルホルダーに2つのゲルを置き、内側のチャンバーの上部にランニングバッファーを充填し、外側のチャンバーを2つのゲルラインマークまで満たして、ゲルチャンバーを準備します。
   2. 1ウェルあたり15μLのサンプルを10ウェル12%ポリアクリルアミドゲルにロードします。タンパク質ラダーレーンには、5 μLをロードします。
   3. ゲルを150Vで約45分間、またはローディングした色素の前面がゲルの底に達するまで実行します。
   4. ゲルが動作している間、転写バッファー(材料表)にファイバーパッド(ゲルごとに2つ)を浸し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜をメタノールに浸して、膜転写の準備をしてください。転写する前に、転写バッファーでメンブレンをすすぎます。
      注：PVDFメンブレンはゲルのサイズに合わせてカットし、転写されるゲルごとに1つのPVDFメンブレンは使用してください。
   5. 半乾燥の転写装置セル上に、転写「サンドイッチ」を組み立てます：下の電極から、(1)あらかじめ浸された繊維パッド、(2)あらかじめ浸されすすぎたPVDF膜、(3)ゲル、(4)2つ目の浸漬された繊維パッドを置きます。
      注: 移送中の気泡を避けるために、'サンドイッチ'をセロジカルピペットで静かに転がし、気泡を強制的に排出してください。ゲルをPDVFメンブレンの上に置いた後は、動かさないでください。
   6. タンパク質の移動を行うには、パワーパックを1時間150mAに設定してください（1つの'サンドイッチ'に対して）。
3. 修飾特異的抗体によるヒストン翻訳後修飾（PTMs）の検出
   1. 転写装置から膜を取り外してください。dH₂Oで短時間すすいでください。
      1. オプションで、小さなプラスチックの箱に膜を覆うのに十分なPonceau-S染色を注ぎ、RTで30−60秒間穏やかに振とうしてインキュベートすることにより、Ponceau-S染色でタンパク質の転写を確認します。Ponceau-S染色を除去し、背景染色が消えてタンパク質バンドが肉眼で見えるようになるまでdH₂Oですすいでください。メンブレンからすべての汚れが除去されるまで、dH₂Oですすぎ続けます。
   2. 小さな染色ボックス内のトリス緩衝生理食塩水(TBS)ブロッキングバッファー）(Table of Materials)で穏やかに揺さぶりながら、RTでブロットを1時間インキュベートすることにより、膜をブロックします。ブロットを覆うのに十分なブロッキングバッファーを使用してください。
      注：タンパク質が存在する膜側が下を向かないように、膜を染色ボックスに直立させて置くように注意してください。
   3. 酵母に反応するヒストン修飾特異的抗体を染色ボックスで一晩インキュベートします。メーカーの仕様に従ってTBSブロッキングバッファーで抗体を希釈します。また、修飾特異的抗体とは異なる宿主種で産生された抗全H3などの適切な核負荷制御も含みます。例えば、ウサギで産生した抗H3S10ph抗体でH3S10phを探る場合は、マウスで産生した抗トータルH3抗体をローディングコントロールとして使用します。必要に応じて、すべてのブロットでこれを繰り返します。
      注:抗体希釈液は、1ヶ月以内に合計3回再利用することができます。4°Cで保存してください。
   4. 自家製のTBS + 0.1%ポリソルベート20（TBST）でメンブレンを4回4回洗浄し、RTでロッキングしながら5分間洗浄します。
   5. RTで1時間、メーカー指定の希釈液(ロバ抗ウサギ680およびロバ抗マウス)で蛍光二次抗体とブロットをインキュベートします。
      注:蛍光二次抗体は、保管中および使用中の両方で光から保護する必要があります。暗いプラスチックの箱でインキュベーションを行うか、アルミホイルで覆います。
   6. TBSTで膜を4回5分間洗い、RTで揺れながらTBSで5分間洗います。
   7. 蛍光ウェスタンブロットイメージングシステムでブロットを2分間視覚化します。抗ウサギ680と抗マウス800の二次抗体をそれぞれ800 nmと700 nmチャネルで視覚化します。
      注:複製はセクション1から独立して行われます。これらの実験でデータを適切に解釈するためには、抗体のシグナル応答がシグナル応答が線形である範囲内にあることを確認する必要があります。

材料

Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10x Running Buffer			混合液:グリシン141.65 g(ThermoFisher BP381-1)、Tizmaベース30.3 g(Sigma-Aldrich T6066)、ドデシル硫酸ナトリウム10 g(Sigma-Aldrich L3771)、および1 L脱イオン水、pH 8.8。
12%ポリアクリルアミドゲル<	456-1041
Sigma-Aldrich	M3148	<
MilliporeSigma	07-353 (ロット番号 2762291)	希釈率:1/1000
アンチアセチルヒストン H4 (Lys16) 一次抗体	Abcam	ab109463 (ロット番号GR187780)	希釈率:1/2000<
Abcam	ab46983 (ロット番号GR71882)	希釈率:1/5000<
Abcam	ab9049 (ロット番号GR266894, GR3236147)	希釈:1/1000
Anti-Histone H3 Primary Antibody	Abcam	ab24834 (ロット番号GR236539, GR174196, GR3194335)	核装填制御;希釈率: 1/2000
抗リン酸化ヒストンH2B (Thr129) 一次抗体	Abcam	ab188292 (ロット番号GR211874)	希釈率:1/1000
抗リン酸化ヒストンH3 (Ser10) 一次抗体	Abcam	ab5176 (ロット番号GR264582, GR192662, GR3217296)	希釈:1/1000<
エッペンドルフ	6133000010
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
ロバ反マウスIRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (ロット番号 C60301-05, C61116-02, C80108-05)	希釈: 1/5000
ロバ反ウサギ IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073 (ロット番号 C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	希釈率: 1/2500<
Sigma-Aldrich	E7023
極厚のしみ紙(濾紙)	BIO-RAD	1703968
Immobilon-FLトランスファーメンブレン<	IPFL00010
Loading Dye			Mix: 1.2 g ドデシル硫酸ナトリウム、6 mg ブロモフェノールブルー (Sigma-Aldrich B8026)、4.7 mL グリセロール、1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8、0.93 g DL-ジチオスレイトール (Sigma-Aldrich D0632)、および 2.1 mL の脱イオン水。
メタノール	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell	BIO-RAD	1658004
マルチチャンネルピペット	エッペンドルフ	2231300045	<
Qiagen	129114
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biosciences	2800-03
pAG303GAL-a-synuclein-GFP	A. Gitlerからの贈り物
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
A. Gitlerからの贈り物
ポリ(エチレングリコール)(PEG)	Sigma-Aldrich	P4338	50%のw/v溶液を準備します。
Ponceau S Stain	Sigma-Aldrich	P3504	Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v 酢酸 (Sigma-Aldrich 320099), 500 mL 脱イオン水.
PowerPac Basic Power Supply	BIO-RAD	164-5050
		-20°Cで保管してください。6X、ミックス:1.2 gのドデシル硫酸ナトリウム、6 mgのブロモフェノールブルー、0.93 gのDL-ジチオスレイトール、2.1 mLの脱イオン水、4.7 mLのグリセロール、および1.2 mLの0.5 M Trizma塩基、pH 6.8。
水酸化ナトリウム	Sigma-Aldrich	221465<
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)			Mix: 100 mL 10X TBS、1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949)、900 mLの脱イオン水。
TBSブロッキングバッファ	LI-COR	927-5000
BIO-RAD	170-3940
TransferBuffer			Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL メタノール, 1 g dodecyl sulfate, 1.6 L 脱イオン水.
Tris-Buffered Saline (TBS)			10X, 7.6 pH, 溶液:トリズマ塩基24gと塩化ナトリウム88gを混合します(Sigma-Aldrich S7653)。脱イオン水で1Lまで満たします。
WT 303 S. cerevisiae yeast	J. Shorterからの贈り物

td style='width:108pt;'>BIO-RADtd style='height:15.5pt;width:135pt;'>2-mercaptoethanoltd style='height:46.5pt;width:135pt;'>アンチアセチルヒストンH3 (Lys14) 一次抗体td style='height:46.5pt;width:135pt;'>抗アセチルヒストンH4 (Lys12) 一次抗体td style='height:46.5pt;width:135pt;'>抗ジメチルヒストンH3 (Lys36) 一次抗体td style='height:15.5pt;width:135pt;'>BioPhotometer D30td style='height％ 15.5pt;width:135pt;'>エタノールtd style='width:108pt;'>MilliporeSigmatd style='height:15.75pt;width:135pt;'>核酸フリーウォーターtd style='height:15.75pt;width:135pt;'>pAG303GAL-TDP-43td style='height:15.75pt;width:135pt;'> dodecyl sulfate Loading Buffertd style='width:314pt;'>0.2 M溶液を準備します。