腫瘍細胞浸潤の3次元スフェロイドモデルの生成

要約

出典:Guyon, J., et al.膠芽腫の3Dスフェロイドモデル. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、腫瘍細胞浸潤の3次元スフェロイドモデルの生成を示しています。スフェロイドは、ヒトの脳腫瘍細胞から形成され、コラーゲンマトリックスに埋め込まれています。スフェロイド末梢の腫瘍細胞は浸潤性の表現型を採用し、プロテアーゼを分泌してコラーゲンを分解し、周囲のマトリックスに侵入するために前進します。

プロトコル

1. 均一なサイズの腫瘍スフェロイドの生成

注:幹様細胞は、B27サプリメント、ヘパリン、線維芽細胞成長因子2）(FGF-2)、ペニシリン、およびストレプトマイシンで補完された神経基底培地で培養されます。これらの細胞は、培養中に自発的にスフェロイドを形成します。

1. 腫瘍細胞を5mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、0.5-1mLの解離酵素で細胞を37°Cで5分間インキュベートします。
2. 4-4.5 mLのPBSで洗浄し、10 mLの完全増殖培地(完全神経基礎培地、cNBM)を加えます。
3. トリパンブルーとセルカウントチャンバースライドによる自動カウント技術を使用してセルをカウントします。
4. スフェロイドごとに10個の⁴個の細胞を持つ100個のスフェロイドを生成するには（好ましいサイズに応じて）、8mLのNBMに10個の⁶個の細胞を2mLの2%メチルセルロースと混合します。
5. 懸濁液を滅菌システム容器に移し、マルチチャンネルピペットで100μL/ウェルを96ウェルの丸い底板に分注します。
6. プレートを37°C、5%の_CO2、95%の湿度でインキュベートします。同じサイズのスフェロイドが形成され、3〜4日後に使用できます。

2. 3次元実験

1. Invasion
   1. Preparation
      1. 最終濃度1 mg/mL、1x PBS、0.023xV_{コラーゲン}、1 M水酸化ナトリウム、滅菌H₂OのI型コラーゲンを含む氷上のチューブにコラーゲンマトリックスを調製します。溶液を氷上で30分間インキュベー
      トします。
      2. 丸底ウェルプレートからスフェロイドを500μLのチューブで採取し、200μLの1x PBSで2回洗浄します。
      3. スフェロイドをコラーゲンマトリックスの100μLに注意深くピペットで入れ、通常の96ウェルプレートのウェルの中央に挿入します。
      4. コラーゲンゲルを37°Cで30分間インキュベートし、その後、ゲルの上にcNBMを加えます。阻害剤または活性化剤(例えば、図1B、1Cに示すような塩化水素)をこのステップで培地に添加することができる。
   2. 画像の取得と分析
      1. コラーゲンインクルージョンの24時間後に、ビデオ顕微鏡で明視野モードで順番に写真を撮ります。
      2. フィジーを使用して、手動または半自動の方法で画像を分析します。手動で行うには、フリーハンド選択ツールで回転楕円体のコアと総面積を描画し、コア面積で合計面積を差し引いて各回転楕円体の侵襲領域を測定します。半自動的な方法で画像を分析するには、マクロを使用して侵襲領域を特定します。

結果

図1:増殖、浸潤、または遊走アッセイにおける膠芽腫P3スフェロイド。 (A) 増殖アッセイ。左パネル:DMSOをコントロールとして、または時間0または72時間で20μMのロテノン(呼吸鎖複合体I阻害剤)を使用した代表的な写真。右パネル:画像内で破線で表された回転楕円体の面積の定量化。スケール = 250 μm. (B) コラーゲンマトリックスのインベージョンアッセイ。左パネル:20 mM塩化水素の有無にかかわらず、0時間または24時間での代表的な写真。右パネル:侵襲領域の定量化。スケール = 100 μm. (C) マトリゲルコーティングの移行アッセイ。左パネル:時間0または24時間における明視野モードの代表的な画像。拡大された領域は下部パネ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96 井戸丸底板	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	4°Cで保存、球体解離酵素
B27	Gibco	12587	-20 °Cで保存、使用
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	-20 °Cで保存、使用
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	4 °C
メチルセルロース	シグマ	M0512	NBMで希釈して最終濃度
NBM	Gibco	21103-049	4°C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	4 °C
ペニシリン - ストレプトマイシン	Gibco	15140-122	4 °C
Type I コラーゲン	コーニング	354236	4°Cで保存

前に解凍前に解凍で保存を2%にで保存で保存で保存