方法論記事

ELISAを用いた神経変性疾患関連タンパク質α-シヌクレインの検出

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2025年4月28日

この記事について

要約

出典:Bétemps, D., et al., ヒトA53T変異α-シヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳におけるELISA強化による疾患関連α-シヌクレインの検出.J. Vis. Exp. (2015).

このビデオでは、ELISAを使用してトランスジェニックマウスの脳組織中の神経変性疾患関連タンパク質α-シヌクレインを検出する手順を示しています。このステップには、組織の均質化、遠心分離、およびα-シヌクレインタンパク質のELISA検出が含まれ、その疾患関連型を定量化します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 解剖された脳領域からのα-Synuclein（αS）抽出

  1. 氷上の35mmのプラスチック製シャーレで、海馬を解剖するときを除いて端が一緒に保たれている2つのフォーシペスを使用して、低倍率の拡大鏡(8倍倍)で脳全体を解剖します。脳の完全性を保つために、10分を超えないようにしてください。脳を右側を上にして、次の脳領域をこの順序で取得します：<ol style='list-style-type:decimal;'
  2. 2つの嗅球のうちの1つを、そのすぐ後ろに置かれた鉗子を使用して分離します。下向きに動かして脳から切り離します。2 番目の電球に対してこの操作を繰り返します。
  3. 鉗子を2つの皮質の間にゆっくりと挟み込み、それを前方に移動させて、2つの皮質の解離を促進します。1つの鉗子で脳を所定の位置に保持し、別の鉗子を使用して皮質を海馬から分離します。
  4. 鉗子を皮質の2mm下に配置します。海馬の上部が見えるまで、鉗子に穏やかな圧力をかけ続けます。皮質の最初の部分をはがし、2番目の部分で繰り返します。鉗子を使用して、海馬から始まり、脳の前部に向かって移動する2つの皮質を分離します。
  5. 開いた鉗子を海馬の1つの周りに配置します。海馬の下部にある鉗子を閉じてから、できるだけ回復するようにゆっくりと取り外します。2番目の海馬についても手順を繰り返します。
  6. 開いた鉗子を線条片の下に置き、脳からそっと離します。鉗子を使用して、線条体から残っている皮質を取り除きます。2番目の線条体についてこの手順を繰り返します。
  7. 鉗子を使用して小脳の輪郭を2mm緩やかに押し下げ、脳からの分離を促進します。鉗子を小脳のすぐ後ろに置き、鉗子を前方に動かして鉗子を取り除きます。
  8. 鉗子の広い部分を使用して中脳を持ち上げ、脳幹と結合する場所をはっきりと確認します。接合部を垂直に切開し、脳幹を切除します。
  9. 鉗子を中脳の後ろに置きます。これは4つの丸みを帯びた構造で構成されています。中脳が残りの脳から完全に分離されるまで、垂直に切開します。
  • 利用可能な組織の数に応じて、高塩分(HS)バッファーに可変の割合(重量/体積)のホモジネートを準備します：10〜30 mgの重量の場合は5%、30〜80 mgの重量の場合は10%、80 mgを超える場合は20%のホモジネートを使用してください。
    1. ホモジネートの期待%を得るために、解剖された脳領域に適切な量のHSバッファを追加してください。
    2. Vortexを行い、組織がHSバッファに完全に浸っていることを確認してください。
    3. 解剖された脳領域または頸髄から調製されたサンプルを、ホウケイ酸ガラス管と2つの乳棒AとBからなる組織グラインダーで均質化します。
    4. 直接チューブに押しつぶすために各脳領域を注ぎます。乳棒Aをチューブに挿入して引っ込めます。この動きを約10回繰り返して、組織を解離させます。次に、乳棒Bを使用して、さらに20回の動きで組織の粉砕を続けます。ホモジネートを1 mLのトランスファーピペットで1.5 mLのチューブに移します。
  • サンプルを1,000 x gで4°Cで5分間遠心分離し、粉砕されていない脳の断片を除去します。上清を取り出し、200 μlのアリコートに分割し、その後の分析のために-80°Cに保ちます。

    • 1. ELISA

    1. によるαSの検出コーティング抗体を0.01 ng/mlに希釈します。抗αSウサギポリクローナル抗体またはモノクローナルクローン42抗体を50 mM Na2CO3/NaHCO3バッファー(pH 9.6)で使用してください。
    2. 96ウェルマイクロプレートにこのコーティング溶液のウェルあたり100μlをコーティングし、4°CO/Nで放置します。ELISAのコーティング溶液中の抗αSウサギポリクローナル抗体を、検出抗体syn514、clone 42、LB509、AS11、4D6、または8A5を使用して使用してください。抗αSモノクローナル抗体クローン42をコーティング液として使用し、抗pSer129αS検出抗体と組み合わせて使用します。
      注: 必要に応じて、ELISAが実行される前に、プレートを1週間4°Cに保つことができます。
    3. プレートワッシャーを使用して、ウェルごとに0.05% Tween 20 (PBST)のリン酸緩衝生理食塩水300μlでプレートを5回洗浄してください。このステップから先は、インキュベーションはRTで行われます。
    4. ウェルごとに200μlのT20 PBS(リン酸緩衝生理食塩水)ブロッキングバッファーを追加してください。150rpmで1時間振とうします。プレートをPBSTで5回洗浄します。
    5. 脳のホモジネートを希釈し(PBST BSA 1%で20%ホモジネートの1:100、10%ホモジネートの1:50、5%ホモジネートの1:25を希釈)、各ウェルに100μlを加えます。その後、150rpmで振とうしながら2時間インキュベートします。プレートをPBSTで5回洗浄します。
    6. 材料リストに記載されている希釈率で、ウシ血清アルブミン（BSA）1%のPBSTに異なるαS検出抗体を追加してください。150rpmで1時間インキュベートします。プレートをPBSTで5回洗浄します。
    7. 150 rpmで振とうしながら、BSA 1%を添加したPBSTで1:8,000に希釈した抗マウスまたは抗ウサギのIgG HRPコンジュゲートを1時間追加してください。プレートをPBSTで5回洗浄します。
    8. 各ウェルに3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)溶液100μlを加え、150rpmで振とうしながら暗所で15分間インキュベー
      9. トします。
    9. ウェルごとに100μlの1N HClを加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定してください。
    10. データ分析のために、マウスの脳サンプル（ブランクウェル）を除く全ての試薬を含むウェルで得られたOD値を、分析された各サンプルで測定したOD値から減算してください。

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    LB509 Abcamab27766検出抗体 1/2000
    AS11 Ansesで生産 検出抗体 1/1000
    4D6 アブカムab1903検出抗体 1/2000
    PSer129 ab59264検出抗体 1/3000
    PSer129 EP1536Y Abcamab51253検出抗体 1/1000
    Syn514 Abcamab24717検出抗体 1/500<
    BD Biosciences610787コーティングおよび検出抗体 (1/2000)
    8A5 < <AB5038Pコーティング抗体
    抗マウスIgG HRPコンジュゲート Southern Biotech1010-05
    アンチウサギIgG HRPコンジュゲート Southern Biotech4010-05
    ヤギ抗マウスIgG HRPコンジュゲート Dianova115-035-164
    HS bufferTris-HCl 50 mMEuromedex26-128-3094-BpH 7.5に調整し、4°C
    NaCl 750 mMEuromedex1112-A
    EDTA 5 mMEuromedexEU0007-B
    DTT 1 mMSigma43815
    PBSリン酸水素二ナトリウム1 mMEuromedex1309pH 7.5
    リン酸一カリウム 1.5 mMEuromedex2018
    NaCl 137 mMEuromedex1112-A
    KCl 2.7 mMEuromedexP017
    Tween 20 Euromedex2001-C
    BSA <A7906
    Microplate MaxiSorpTM <442404
    炭酸タンポン 50 mM pH 9.6炭酸ナトリウム十水和物Sigma71360<
    重炭酸ナトリウムMerk63293.36 g/L, pH9.6
    スーパーブロックT20 PBSブロッキングバッファ PierceE6423H10 X concentrated
    TMB SigmaT0440ELISA
    TMB Analytik Jena AG847-0104200302エピトープマッピング
    HCl 1N Chimie plus40030
    リボライザー ThermoFast prep FP120<
    Grinding tubes Biorad355-1197
    プレートワッシャー <Columbus Pro
    Plate reader BioradModel 680
    低電力拡大鏡 VWR630-1062X8
    Forceps Dumont#7 <14097解剖ステップ
    トランスファーピペット 1ml Samso Samso43231
    1.5 ml tubes Dutscher33290
    td style='width:200pt;'>Abcamtd style='height:31.0pt;width:200pt;'>Clone 42td style='width:200pt;'>アンダーソン博士提供 style='width:200pt;'td style='width:200pt;'>Milliporeに保ちますtd style='width:200pt;'>Sigmatd style='width:200pt;'>Thermo Scientifictd style='width:200pt;'>2.86 g/Lに使用に使用td style='width:200pt;'>このステップで氷の上をキープtd style='width:200pt;'>Tecan倍率td style='width:200pt;'>WPIの場合

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    タグ

    ELISA

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